A fluoxetina (FLU) é um antidepressivo amplamente prescrito para depressão e outras doenças neurológicas. Além da forma inalterada, seu metabólito, a norfluoxetina (NOR), também possui atividade farmacológica. A determinação de FLU em fluidos biológicos é necessária para fins de monitorização terapêutica (TDM), no desenvolvimento de novas formulações, bem como em análises toxicológicas e forenses. Técnicas miniaturizadas, como a microextração em fase líquida (LPME), vêm sendo utilizadas no preparo de amostras biológicas, sendo simples, sensíveis e ambientalmente adequadas. A cromatografia líquida é considerada a técnica de escolha para a análise de FLU e NOR, porque em sua forma não derivatizada esses compostos são incompatíveis com a cromatografia gasosa (GC), a qual seria de interesse por sua simplicidade e baixo custo. Este trabalho apresenta o desenvolvimento de um método para a análise de FLU e NOR em plasma por LPME-GC-MS utilizando derivatização no injetor (IPD). Após derivatizados, os fármacos se tornam adequados à análise, sendo o processo online promissor devido ao baixo consumo de agente derivatizante e não adição de etapas no preparo de amostras. Foram utilizadas fibras ocas de polipropileno (600 μm de diâmetro interno, 200 μm de espessura da parede, e 0,2 μm de tamanho dos poros) para a extração por LPME, as análises foram feitas em um GC-MS 2010 Plus Shimadzu®. Um microlitro de agente derivatizante, MBTFA (n-metil-bis trifluoroacetamida) e 2 μL de extrato foram injetados diretamente no injetor do GC. O processo de derivatização online foi otimizado quanto à vazão do gás de arraste, temperatura do injetor e da coluna, injeção sob alta pressão (HPI), e tipo de liner. O processo de extração foi avaliado quanto ao efeito de salting out, pH da fase doadora e precipitação de proteínas plasmáticas. Além desses, os parâmetros termodinâmicos (tipo de solvente, volume e concentração do tampão e diluição da amostra), e cinéticos (tempo de extração e velocidade de agitação) foram otimizados. Para a derivatização online foram otimizadas vazão de 1,7 mL/min, injetor a 300 °C e temperatura inicial da coluna de 140 °C, utilizando o modo HPI a 250 kPa e liner split. Utilizando as condições cromatográficas otimizadas e nortriptilina como padrão interno o método proposto foi: 1 mL de plasma após a precipitação de proteínas com solução de ZnSO4/NaOH, 4 mL de tampão fosfato 0,1 mol/L pH 11, fibra oca de 3,7 cm com 10 μL de éter dihexílico extraindo por 30 min a 700 rpm. O método mostrou-se linear para FLU entre 10 e 500 ng/mL (R2 = 0,9973), e para NOR entre 15 e 500 ng/mL (R2 = 0,9972). Os limites de detecção e quantificação foram de 3 e 10 ng/mL, e de 5 e 15 ng/mL para a FLU e NOR, respectivamente. A precisão e exatidão foram avaliadas para 3 concentrações dos analitos (50, 250 e 500 ng/mL). Seletividade, estabilidade de curta duração e recuperação também foram avaliadas. O método foi aplicado com sucesso na análise de plasma de 5 pacientes em tratamento com FLU. O método desenvolvido é rápido, sensível e ambientalmente adequado, reduzindo significativamente o uso de solventes tanto no preparo de amostras quanto no processo de separação. A derivatização online com MBTFA, inédita até o momento para a análise de fármacos por GC, mostrou resultados promissores podendo ser utilizada como uma alternativa a análises por HPLC. / Fluoxetine (FLU) is a widely prescribed antidepressant for major depression and other neurological diseases. In addition to the unchanged form, its metabolite – norfluoxetine (NOR) – also has pharmacological activity. Determination of FLU in biofluids is necessary in therapeutic drug monitoring (TDM), in new formulation development, as well as in analytical and forensic toxicology. Miniaturized techniques such as LPME have been used in biological sample preparation, being simple, sensitive, and environmentally friendly. Liquid chromatography is considered the technique of choice for the analysis of FLU and NOR, because in its underivatized form these compounds are incompatible with gas chromatography (GC); which would be of interest for its simplicity and low cost. This work presents the development of a method for FLU and NOR analysis in plasma by LPME-GC-MS using injection-port derivatization (IPD). The process made these drugs suitable for analysis, being the online procedure promising due to low derivatizing agent consumption, as well as not adding steps in sample preparation. Polypropylene hollow-fibers (600 μm inside diameter, 200 μm wall thickness, and 0.2 μm pore size) were used for extraction and analyses were performed in a GC-MS 2010 Plus Shimadzu®. One microliter of derivatizing agent MBTFA (n-methyl-bis trifluoroacetamide) and 2 μL of extract were directly injected into the GC port. The IPD process was optimized for carrier gas flow rate, injector and column temperature, high-pressure injection mode (HPI), and type of insert liner. The extraction was evaluated for salting out effect, donor phase pH, and plasma proteins precipitation; additionally, two factorial designs were performed to verify the influence of thermodynamic parameters (type and volume of solvent, buffer concentration and dilution of the sample), and of kinetic parameters (extraction time and stirring speed) on extraction. For the IPD were optimized a flow rate of 1.7 mL/min, an injector temperature of 300 °C and a column initial temperature of 140 °C, using HPI at 250 kPa and split liner. Using the optimized chromatographic conditions and nortriptyline as the internal standard the proposed method was: 1 mL of plasma after protein precipitation with ZnSO4/NaOH, 4 mL of 0.1 mol/L phosphate buffer at pH 11. Hollow-fiber pieces of 3.7 cm with 10 μL of dihexyl ether for 30 min at 700 rpm were used for extraction. Linearity for FLU was between 10 and 500 ng/mL (R2 = 0.9973), and for NOR between 15 and 500 ng/mL (R2 = 0.9972). Detection and quantification limits of 3 and 10 ng/mL, and of 5 and 15 ng/mL for FLU and NOR, respectively. The intra-assay and inter-assay precision and accuracy were studied for three concentrations (50, 250 e 500 ng/mL). Selectivity, short term stability and extraction efficiency were also evaluated. After validated the method was successfully applied to the analysis of samples from 5 patients under fluoxetine treatment The developed method is fast, sensible and environmentally friendly, significantly reducing both the use of solvents in sample preparation and separation. The IPD with MBTFA, unpublished until the moment for the GC analysis of drugs, has been showing promising results and may be used as an alternative to HPLC analysis. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/177 |
| Date | 09 December 2011 |
| Creators | OLIVEIRA, Antônio Felipe Felicioni |
| Contributors | SANTOS NETO, Álvaro José dos, http://lattes.cnpq.br/1690612352319705, FIGUEIREDO, Eduardo Costa de, YONAMINE, Maurício, BORALLI, Vanessa Bergamin |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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