Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen.
Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären.
Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate.
In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden. / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that.
The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde.
Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives.
In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:14-qucosa-226457 |
| Date | 25 July 2017 |
| Creators | Röber, Nadja |
| Contributors | Technische Universität Dresden, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Prof. Dr. rer. nat. et med. habil. Michael Bachmann, Prof. Dr. rer. nat. et med. habil. Michael Bachmann, Prof. Dr. med. Angela Rösen-Wolff |
| Publisher | Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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