Memoria para optar al titulo profesional de Bioquímico / En la vía directa de la síntesis de glicógeno en oocitos de rana participan cuatro enzimas que
son la hexoquinasa (HK), la fosfoglucomutasa (PGM), la UDP-glucosa pirofoforilasa (UDPGPPasa)
y la glicógeno sintasa (GS). La fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2) cataliza la conversión
reversible de glucosa-6-fosfato (glc-6-P) en glucosa-1-fosfato (glc-1-P). Por otro lado, la
glicógeno sintasa (EC 2.4.1.11) cataliza la incorporación de glucosa en glicógeno, transfiriendo
un residuo glucosilo desde UDP-glucosa a un extremo no reductor del glicógeno. El análisis del
control metabólico (MCA) proporciona un enfoque particular para estudiar la regulación del
metabolismo, ya que permite cuantificar el efecto que ejerce una enzima sobre el flujo de una vía
metabólica, en términos de su coeficiente de control de flujo. En este trabajo se aplicaron los
postulados del análisis del control metabólico para estudiar el control que ejercen la PGM y la
GS sobre el flujo de la vía directa de la síntesis de glicógeno.
La actividad de la PGM se midió espectrofotométricamente cuantificando el NADH producido
al acoplar la reacción de la glucosa-6-P deshidrogenasa a la producción de glc-6-P. La actividad
endógena de PGM en oocitos resultó ser igual a 41 ± 3,1 mU por oocito, medida entre los meses
de septiembre y enero, y de 9,4 ± 0,93 mU por oocito, medida entre los meses de abril y agosto.
Su actividad máxima es a pH 7,5. La cinética para el sustrato glc-1-P es hiperbólica, con una Km
app de 0,16 mM.
Para determinar el control que ejerce la PGM sobre el flujo metabólico de la vía directa de la
síntesis de glicógeno, se aumentó la actividad intracelular de la PGM por medio de
microinyección de enzima exógena a oocitos de Caudiverbera caudiverbera en estadio VI de
desarrollo. El coeficiente de control medido para la PGM resultó ser igual a 0,19. Este valor
indica que la PGM ejercería un bajo control sobre el flujo metabólico de la vía directa.
La actividad de la GS se midió usando un radioensayo que cuantifica la incorporación de
glucosa marcada en glicógeno a partir de UDP-glucosa radiactiva. La actividad endógena de la
GS en oocitos resultó ser igual a 0,7 ± 0,03 mU por oocito, independiente de la época del año en
que se mide. No se logró determinar el control que ejerce la GS sobre el flujo metabólico de la vía directa de
síntesis de glicógeno. Ello debido a que, por una parte, no hay disponibilidad de la enzima
comercial en el mercado. Por otro lado, tampoco fue posible tener la cantidad de enzima
requerida al intentar purificarla a partir de músculo de rana. La purificación consistía en tres
etapas, que incluían la obtención de un pellet rico en glicógeno, y dos cromatografias en DEAEcelulosa
y Sephacryl S-200. La enzima se purificó 684 veces, pero no se logró concentrar lo
suficiente como para poder ser microinyectada dentro del oocito y determinar así el coeficiente
de control para la GS / In amphibian oocytes, the direct pathway for glycogen synthesis includes four enzymes
which are hexokinase (HK), phosphoglucomutase (PGM), UDP-glucose pyrophosphorylase
(UGPase) and glycogen synthase (GS). Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) catalyzes the
reversible conversion of glucose-6-phosphate (glc-6-P) into glucose-1-phosphate (glc-1-P).
Glycogen synthase (EC 2.4.1.11) catalyzes the addition of a glucose residue to the non-reducing
end of glycogen, using UDP-glucose as the substrate. Metabolic Control Analysis (MCA)
provides a singular vision to the study of metabolic control. It allows quantification of the effect
that a particular enzyme exerts upon the flux through the pathway in terms of the flux control
coefficient. In this work we have applied MCA in order to study the control that PGM and GS
exert over the flux in the direct pathway for glycogen synthesis.
PGM activity was spectrophotometrically measured by quantifying NADH produced, in a
coupled reaction catalyzed by glucose-6-P dehydrogenase. The endogenous PGM activity
measured in the oocytes between september and january was 41 ± 3.1 mU per oocyte, while
between april and august it was 9.4 ± 0.93 mU per oocyte. The maximal activity was found at
pH 7.5. The kinetic for glc-1-P was hyperbolic, with a Km app of 0.16 mM.
In order to determine the control that PGM exerts over the metabolic flux in the direct pathway
for glycogen synthesis, we increased PGM activity by microinjecting exogenous enzyme into
Caudiverbera caudiverbera stage VI oocytes. A control coefficient value of 0.19 was found for
PGM. This value indicates that PGM exerts a low control over the metabolic flux in the direct
pathway for glycogen synthesis.
GS activity was measured using a radioactive assay that quantifies the incorporation of glucose
into glycogen, using radiolabelled UDP-glucose as the substrate. The endogenous activity found
for GS in the oocytes was about 0.7 ± 0.03 mU per oocyte, irrespective of the season of the year.
To determine the control that GS exerts over the metabolic flux in the direct pathway for
glycogen synthesis, and due to the lack of a pure commercial enzyme, we intended to purify the enzyme from frog´s muscle. The purification procedure involved three steps, beginning with the
obtention of a glycogen-rich pellet, and continuing with a DEAE-cellulose and Sephacryl S-200
chromatographies. We obtained an enzyme that was purified 684 times, but efforts to
concentrate the enzyme to obtain the amount required for microinjection were unsuccesful
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105537 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Quiroga Roger, Diego René |
| Contributors | Kettlun Maluk, Ana María, Preller Simmons, Ana, Ureta, Tito, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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