Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndarCDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionalsdescrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guardencerta similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria esdescriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenadesGto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w iYMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són activescom tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenatreductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localitzacióde tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportadorperoxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D´altre banda,Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxenper estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependènciad'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb lapresència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant Dgto1és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatiómenor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant Dgtt2Dgtt1 Dgto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat delmutant Dgto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni,indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència deGTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucratsen la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant Dgto1 creixamb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S.cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniquesfonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi demetionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitatcistationina b-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la sevaactivitat biològica i està conservada en les cistationina b-liasas d'altres espècies defongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de l'estat redox de laproteïna Str3RESÚMENSaccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 yGtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándarCDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionalesdescritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunqueguardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describela caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1,Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimasde esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tioloxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenatoreductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localizaciónde tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportadorperoxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen porestrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de estaexpresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con lapresencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutanteDgto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular deglutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triplemutante Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1,Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es ladificultad del mutante Dgto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuentede carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante estánafectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en laexpresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina.Como consecuencia, el mutante Dgto1 crece con dificultad en ausencia de treonina,serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientementela cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en latransulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ellosugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina b-liasa de Str3mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal.Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y estáconservada en las cistationina b-liasas de otras especies de hongos, este residuopodría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3.SUMARYSUMMARYSaccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 andGtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrateCDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that havebeen established based on the structure of mammalian GST, although they keep certainstructural similarity with Zeta class members. In this report, we describe thecharacterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3,coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes ofthis class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases,dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1,is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminalPTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporterPex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at thecytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although theexpression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genesdepends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with thepresence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absenceof GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reducesthe intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. Thisphenotype is related to cadmium sensitivity of the Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 triple mutant,indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity.Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defectwith oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions areaffected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine,serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negativelythe expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As aconsecuence, the Dgto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine orcistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, aprocess that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 couldregulate the cystathionine b-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductaseactivity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is importantfor the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residuecould be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/8084 |
| Date | 19 January 2007 |
| Creators | Barreto Parra, Lina Patricia |
| Contributors | Herrero Perpiñán, Enrique, Universitat de Lleida. Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.003 seconds