Orientador : Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientadoras : Drª. Amanda do Rocio Andrade Pires ; Drª. Julie St-Pierre / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 26/10/2016 / Inclui referências: f. 78-97 / Resumo: Diferentes atividades biológicas têm sido atribuídas aos compostos mesoiônicos. Para a sidnona SYD-1 (3-[4-cloro-3-nitrofenil]-1,2,3-oxadiazolio-5-olato) foi descrita significativa atividade antitumoral contra Sarcoma 180, carcinoma de Erlich e Walker-256. Neste estudo foram avaliados os efeitos do SYD-1 em células de hepatocarcinoma humano (HepG2), considerando sua elevada taxa de mortalidade e a existência de apenas um quimioterápico para o seu tratamento. Os efeitos do mesoiônico foram avaliados em células cultivadas em meio DMEM alta glucose (AG) e DMEM sem glucose e com galactose/glutamina (GAL) para direcionar o metabolismo destas células para a via glicolítica e fosforilação oxidativa, respectivamente. Ainda, com o fim de estabelecer uma possível seletividade, alguns ensaios também foram realizados em hepatócitos de rato em cultura mantidos em meio DMEM AG. SYD-1 reduziu de forma concentração dependente a viabilidade das células HepG2, avaliada por quatro metodologias diferentes. Pelo método do MTT, as reduções foram de ~22% e ~49% para 50 ?M de SYD-1, para células cultivadas em meio AG e GAL, respectivamente. Resultado similar foi obtido com a coloração com cristal violeta e atividade da enzima LDH no meio extracelular. No entanto, nenhum efeito foi observado utilizando a metodologia de exclusão do azul de tripan. Todos os estados da respiração (basal, leak e desacoplado), em células cultivadas, foram inibidos após o tratamento das células HepG2 com SYD-1 (25 e 50 ?M), sendo mais acentuado o efeito nas culturas mantidas em meio GAL. Nas mesmas condições, foi observada a diminuição nos níveis celulares de ATP (~29%). Os níveis de piruvato, por sua vez, diminuíram nas células tratadas com 50 ?M do SYD-1, com consequente aumento dos níveis de lactato. Em células cultivadas em meio AG, SYD-1 (50 ?M), após 24h de tratamento, também foi capaz de aumentar a expressão de PGC1? e reduzir a expressão de PGC1?. Após 72h de tratamento, com a mesma concentração de SYD-1, houve um aumento na expressão de PGC1?, bem como seus alvos downstream NFR1, NFR2 e Ndufb5 e, também da expressão de genes relacionados com a atividade antioxidante celular: CAT, PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3). SYD-1 (50 ?M) aumentou a expressão de caspase 3 em células HepG2 mantidas em meio AG, mas houve uma diminuição quando as células foram mantidas em meio GAL. Os níveis dos metabólitos piruvato, citrato ?-cetoglutarato e succinato também se apresentaram aumentados após tratamento com o composto (50 ?M meio AG). SYD-1 (25 ?M) inibiu ABCG2 e não foi substrato para transportadores relacionados à resistência aos tratamentos quimioterápicos (Pgp, ABCG2 e MRP1). SYD-1 diminuiu a viabilidade dos hepatócitos não tumorais somente na maior concentração (50 ?M) após 18h de tratamento. Ensaios com anexina V e iodeto de propídio sugeriram que esta redução deve-se à indução de apoptose nestas células. Considerados em conjunto, os resultados sugerem que o comprometimento de funções mitocondriais pelo SYD-1 está relacionado com sua toxicidade em células HepG2 e que o mesoiônico é um candidato promissor para futuras investigações in vivo, visando sua aplicação para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC). Palavras-chave: Células HepG2; hepatócitos; SYD-1; bioenergética mitocondrial; família de coativadores PGC1; transportadores ABC. / Absract: Several biological activities have been described for mesoionic compounds. The sydnone SYD-1 (3-[4-chloro-3-nitrophenyl]-1,2,3-oxadiazolium-5-olate) has shown a significant antitumour activity against Ehrlich carcinoma, Sarcoma 180 and Walker-256. In this study the effects of the mesoionic compound SYD-1 were evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2), considering its high mortality rate and that only one drug is available for its treatment. The effects of SYD-1 were evaluated on cells grown in high glucose DMEM (AG) or DMEM without glucose and with galactose/glutamine (GAL), with the aim to force the metabolism to glycolytic or oxidative phosphorylation, respectively. Further, in order to establish its selectivity, some assays were also performed in rat hepatocytes grown in AG DMEM. SYD-1 reduced the viability of HepG2 cells in a dose-dependent manner, assessed from four different methods. MTT method showed reductions of ~22% and ~49% in viability after treatment with SYD-1 (50?M) for cells grown in AG and GAL, respectively. Similar results were obtained from staining with crystal violet and release of LDH in the culture medium. However, no effect was observed when the methodology was the exclusion of trypan blue. The respiration states (basal, leak and uncoupled) were inhibited after treatment with SYD-1 (25 and 50 ?M), being the effects more pronounced in cells grown in GAL medium in comparison to AG medium. At the same conditions, it was observed the decrease of ATP levels (~29%). In turn, the levels of pyruvate decreased by the treatment with 50 ?M of SYD-1 while lactate levels increased. In cells grown in AG, SYD-1 (50 ?M) was also able to increase the expression of PGC1? and reduce the expression of PGC1?, after 24h of treatment. After 72h of treatment, SYD-1 (50 ?M) increased the expression of PGC1? as well as its downstream targets NFR1, NFR2 and Ndufb5. The expression of genes related to the antioxidant activity (CAT PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3) were also increased by SYD-1 (50 ?M). The expression of caspase 3 increased in HepG2 cells maintained in AG medium and decreased in cells at GAL medium. The levels of the metabolites pyruvate, citrate, ?-ketoglutarate and succinate were also increased after treatment with the compound (50 ?M - AG medium). SYD-1 (25 ?M) inhibited ABCG2 and was not a substrate of transporters associated to chemotherapy resistance (Pgp, MRP1 and ABCG2). SYD-1 decreased the viability of non-tumour hepatocytes only at the highest concentration (50 ?M) after 18h of treatment. Results of assays with anexin-V and PI suggested that the mesoionic was able to induce apoptosis in these cells. Taken together, these results show that the effects of SYD-1 on mitochondrial functions are related to its cytotoxicity on HepG2 cells and suggest that the mesoionic is a promising candidate for future in-vivo investigations aiming to its use for the treatment of hepatocellular carcinoma. Keywords: HepG2 cells; hepatocytes; SYD-1; mitochondrial bioenergetics, PGC1 family coactivators, ABC transportes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/49418 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Brandt, Anna Paula |
| Contributors | Pires, Amanda do Rocio Andrade, St-Pierre, Julie, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica), Cadena, Silvia Maria Suter Correia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 115 f. : il. algumas color., gráfs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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