Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T23:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2015 / Resumo: A inflamação é uma resposta fisiológica normal à infecção ou lesão tecidual que permite a sobrevivência do indivíduo a diversos agentes lesivos e mantém a homeostase dos tecidos sob uma variedade de condições nocivas. Os neutrófilos têm um papel importante em processos inflamatórios e, na presença de estímulos inflamatórios, como citocinas e quimiocinas, são recrutados da circulação para o tecido inflamado por uma sequência de interações adesivas. Recentemente, novas técnicas in vitro têm levado a importantes avanços no entendimento de patologias vasculares e hematológicas e sistemas microfluídicos, que mimetizam a microcirculação humana, demonstrando a utilidade para o estudo de interações adesivas de células inflamatórias. As interações dos neutrófilos e outros leucócitos com a parede vascular tem contribuição importante para as doenças inflamatórias crônicas, como a anemia falciforme (AF) e aterosclerose, pois podem participar em processos de oclusão vascular. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a hidroxiureia (HU), uma droga utilizada como terapia na AF, modula as propriedades adesivas de neutrófilos quando incubados in vitro com a droga e frente um estímulo inflamatório. Os neutrófilos, isolados do sangue periférico de indivíduos saudáveis, foram estimulados com a citocina TNF-? (Fator de Necrose Tumoral alfa) e tratados com HU em três concentrações (100, 500, 1000 ?M); as propriedades adesivas das células foram avaliadas por ensaios de adesão estática e por ensaios microfluídicos, utilizando como ligantes proteínas expressas no endotélio (ICAM-1 e E-selectina), proteínas da matriz extracelular (fibronectina - FN) e células endoteliais (HUVEC). Além disso, foi analisada a ativação celular (spreading celular, observado como o espalhamento das células redondas que se tornam achatadas sobre um substrato sólido 2D). Observamos que os neutrófilos, quando estimulados com TNF-?, demonstram aumentos significantes na adesão e spreading celular. O pré-tratamento das células com HU reduziu significativamente o spreading dos neutrófilos nas três proteínas estudas (FN, ICAM-1 e E-selectina). Sob condições estáticas, o pré e o pós-tratamento dos neutrófilos com a HU diminuiu significativamente a adesão à FN quando comparados ao estimulados por TNF-?. Nos ensaios de adesão em fluxo, foi possível observar que o pré-tratamento com HU nas três concentrações (100, 500 e 1000 ?M) diminuiu significativamente a adesão dos neutrófilos a FN e o pós-tratamento com HU diminuiu apenas na concentração de 100 ?M. Avaliamos a adesão em fluxo de neutrófilos aderidos a proteínas de adesão presentes no endotélio, ICAM-1 e E-selectina; o pré e o pós-tratamento de neutrófilos com HU diminuiu a suas propriedades adesivas frente ao estímulo inflamatório de TNF-? à proteína E-selectina, enquanto que o pré-tratamento nas três concentrações diminuiu a adesão dos neutrófilos ao ICAM-1 e ao ICAM-1 e E-selectina adicionados juntos ao chip. A técnica de citometria de fluxo demonstrou que as integrinas LFA-1 (CD11a) e Mac-1 (CD11b), mostraram-se aumentadas na superfície dos neutrófilos após estímulo com TNF-?. Todavia, a expressão da L-selectina, mostrou-se diminuída com este potente estímulo inflamatório, provavelmente devido o mecanismo de "shedding" celular. A incubação dos neutrófilos com HU, após o estímulo com o TNF-?, reduziu significativamente a expressão de CD11a nos neutrófilos tratados com HU nas concentrações de 100 e 1000 ?M para níveis de expressão equivalentes ao grupo de neutrófilos não estimulados com TNF-?. Observamos também que houve aumento da presença da integrina LFA-1 (CD11a) na sua conformação ativada, após estímulo com TNF-? e que a pós-incubação das células estimuladas com HU na concentração de 1000 ?M, reduziu a ativação da subunidade CD11a da molécula de adesão LFA-1, comparado ao grupo apenas estimulado com TNF-?. Diante destes resultados, é possível concluir que o tratamento de neutrófilos com HU foi capaz de proteger ou até reverter algumas das ações inflamatórias do TNF-?. A HU é utilizada como uma terapia de uso crônico em pacientes com AF, mas estes dados indicam que a HU também pode exercer efeitos imediatos que são independentes da elevação de hemoglobina fetal. Dados melhor clarificam o mecanismo de ação de HU na AF e sugerem que a droga pode ter potencial para uso em outras doenças inflamatórias. Ainda será necessário entender como a HU exerce estes efeitos anti-inflamatórios nos neutrófilos / Abstract: Inflammation is a normal physiological response to infection or tissue injury that defends against various damaging agents and maintains tissue homeostasis in a variety of deleterious conditions. Neutrophils play an important role in inflammatory processes and, in the presence of inflammatory stimuli, such as cytokines and chemokines, are recruited from the circulation into the inflamed tissue by a sequence of adhesive interactions. Recently, new in vitro techniques have led to significant advances in our understanding of vascular and hematological conditions and microfluidic systems that mimic the human microcirculation have been shown to be useful for the study of adhesive interactions in inflammatory cells. The interaction of neutrophils and other leukocytes with the vascular wall makes an important contribution to chronic inflammatory diseases, such as sickle cell anemia (SCA) and atherosclerosis, as these may participate in vascular occlusion processes. The aim of this study was to evaluate whether hydroxyurea (HU), a drug used as a therapy in SCA, modulates the adhesive properties of neutrophils in vitro under an inflammatory stimulus. The neutrophils isolated from the peripheral blood of healthy subjects were stimulated with the cytokine TNF-? (Tumor Necrosis Factor alpha) and treated with HU in three concentrations (100, 500, 1000 ?M); the adhesive properties of the cells were evaluated by static adhesion assays and microfluidic assays using ligands such as proteins expressed on the endothelium (ICAM-1 and E-selectin), extracellular matrix proteins (fibronectin - FN) and endothelial cells (HUVEC). Furthermore, cellular activation was evaluated as cell spreading (observed when round cells become flattened and spread on a 2D solid substrate). When stimulated with TNF-?, neutrophils presented a significant increase in cell adhesion and spreading. Pre-treatment of cells with HU significantly reduced neutrophil spreading on all three proteins studied (FN, ICAM-1 and E-selectin). Under static conditions, the pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU significantly decreased adhesion to FN, compared to TNF-?-stimulated cells. In the flow adhesion assays, pre-treatment of neutrophils with HU at three concentrations (100, 500 and 1000 ?M) significantly reduced the adhesion of neutrophils to FN and post-treatment with HU decreased only at the concentration of 100 ?M. We evaluated the in vitro flow adhesion of neutrophils to proteins present on endothelial cells, ICAM-1 and E-selectin; pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU decreased their adhesive properties after TNF-? inflammatory stimulus to the E-selectin ligand, while pre-treatment in the three concentrations decreased neutrophil adherence to ICAM-1 ligand and ICAM-1/E-selectin ligands added together to the chip. Flow cytometry demonstrated that the expressions of the integrins LFA-1 (CD11a) and Mac-1 (CD11b) were elevated on the surface of neutrophils after a TNF-? stimulus. However, L-selectin expression was reduced with this potent inflammatory stimulus, probably due to the mechanism of "shedding". Incubation of neutrophils with HU (100 and 1000 ?M), after stimulation with TNF-?, significantly reduced the CD11a expression on neutrophils to levels similar to those found on the neutrophils of the non-TNF-?-stimulated group. We also observed that there was an increased expression of the LFA-1 (CD11a) integrin in its active conformation after stimulation with TNF-? and that, post-incubation with HU (1000 ?M) was able to reduce the activation of the adhesion molecule CD11a (LFA-1 subunit), compared to the group with TNF-? stimulus only. Given these results, it is possible to conclude that treatment of neutrophils with HU was able to protect or even reverse some of the inflammatory actions of TNF-?. HU is used as a chronic therapy in patients with SCA, but our data indicate that HU may also have immediate effects that are independent of the increase in fetal hemoglobin usually observed in patients in therapy. Our results further clarify the mechanism of action of HU in SCA and suggest that this drug may have potential for use in other inflammatory diseases. Further studies will be needed to better comprehend how these HU anti-inflammatory effects act on neutrophils / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/312964 |
| Date | 26 August 2018 |
| Creators | Vital, Daiana Morelli, 1987- |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Zorzetto, Nicola Amanda Conran, 1972-, Gambero, Alessandra, Paula, Erich Vinicius de |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 76 f. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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