L’immunothérapie représente une avancée majeure dans la prise en charge des patients atteints de cancer. L’utilisation thérapeutique récente des anticorps anti-"checkpoints", qui renforcent la réponse immunitaire cellulaire naturelle anti-tumorale, a relancé l’intérêt d’approches d’immunothérapie cellulaire spécifique dans les cancers. Malgré tout, l’identification d'antigènes capables de stimuler efficacement des lymphocytes T (LT) anti-tumoraux représente un obstacle majeur au développement de telles approches. Pour identifier de tels antigènes, des cellules présentatrices d’antigène (CPA) artificielles (CPAA), capables d’exprimer, après transduction gamma-rétrovirale, des peptides directement codés ou des antigènes entiers, dégradés par ces cellules, comme le feraient des CPA humaines, en peptides présentés au sein de la molécule du CMH de classe I la plus fréquente chez l'homme, HLA-A2.1, ont été développées au laboratoire. Ces CPAA sont capables de stimuler efficacement des LT cytotoxiques (LTC) spécifiques contre des antigènes tumoraux. Deux grandes approches d’identification des antigènes tumoraux d’intérêt thérapeutique, ont été utilisées. La première est une approche directe d’identification des peptides basée sur l’élution des peptides HLA-A2.1-restreints présentés par nos CPAA et leur analyse par spectrométrie de masse. La seconde est une approche d’immunologie inverse basée sur des prédictions in silico d’épitopes HLA-A2.1-restreints reposant sur des données biochimiques des poches du CMH. Dans les deux approches, des tests fonctionnels d’activation de LTC spécifiques ont été effectués avec nos CPAA. Dans la première étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie en phase liquide, qui a été jusqu'à présent la technologie permettant l'identification rapide de centaines de ligands du CMH dans différentes approches expérimentales. En partant de CPAA codant les peptides immunogènes connus M1m, M1 ou FSP02, des LTC spécifiques de ces peptides ont été obtenus, et nous avons réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. En partant de CPAA codant les protéines entières desquelles ces peptides sont dérivés, des LTC spécifiques des peptides ont également été obtenus mais nous n’avons pas réussi à les caractériser par spectrométrie de masse. Des peptides très immunogènes, capables de stimuler de fortes réponses immunitaires cellulaires anti-tumorales, peuvent donc échapper à une détection par spectrométrie de masse, rendant ainsi discutable l'utilisation de cette technique pour sélectionner des peptides d’intérêt clinique. Dans la deuxième étude, nous sommes partis de peptides prédits. Nous avons pu monter des réponses immunitaires spécifiques contre les néoépitopes FSP25 et FSP26 prédits in silico, dérivés de la protéine mutée CASP5 (-1) retrouvée chez 60% de patients atteints de cancer colorectal (CCR) à instabilité microsatellitaire (IMS). La CASP5 est impliquée dans l’apoptose et nous avons montré que les patients atteints d’un CCR à IMS présentant cette mutation avaient un moins bon pronostic. Nous avons également montré que chez des patients HLA-A2+ atteints d’un CCR à IMS présentant la mutation, des LTC pouvaient être obtenus contre les épitopes FSP25 et FSP26, capables de lyser spécifiquement la lignée cellulaire HLA-A2.1+ HCT116 dérivée d’un CCR à IMS présentant également la mutation, faisant de la protéine mutée CASP5 (-1) une cible thérapeutique de choix chez ces patients. Dans ces deux études, nos CPAA constituaient un outil de choix pour le développement d’approches d’immunothérapie spécifique personnalisée, soit cellulaire adoptive, pour déterminer quels antigènes devraient être ciblés ou pour directement activer et amplifier in vitro des LT injectés in vivo, soit vaccinale, pour déterminer les antigènes les plus immunogènes à inclure dans un vaccin efficace. / Immunotherapy represents a major advance in cancer patient management. Recent use of anti-checkpoint antibodies, that reinforce the natural cellular anti-tumor immune response, has revived interest for specific cellular immunotherapy approaches in cancers. Nevertheless, the difficulty of identifying highly immunogenic tumor antigens capable of specifically stimulating efficient anti-tumor T lymphocytes (TLs) is a considerable barrier to the development of such approaches. In order to identify such antigens, artificial antigen presenting cells (AAPCs) expressing the most common HLA class I molecule, HLA-A2.1, were developed in the laboratory. After gammaretroviral transduction, these AAPCs also express a directly-encoded peptide of interest or a full-length antigen, degraded by these cells into peptides as human antigen presenting cells (APCs) do. These AAPCs are capable of efficiently stimulating specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) against tumor antigens. Two major approaches for the identification of tumor antigens of therapeutic interest have been used. The first one is a direct approach of identification of HLA-A2.1-restricted peptides based on the elution of HLA-A2.1-peptide complexes expressed by our AAPCs and their analysis by mass spectrometry. The second one is a reverse immunology approach based on in silico predictions of HLA-A2.1-restricted epitopes using available MHC pocket biochemical data. In both approaches, functional tests were performed in vitro with our AAPCs to test the immunogenicity of the studied peptides. In the first study, we used tandem mass spectrometry coupled with liquid chromatography, which has been until today the technology of choice for the rapid identification of hundreds of MHC ligands in different experimental approaches. Starting from AAPCs encoding known immunogenic M1m, M1 and FSP02 peptides, specific CTLs could be obtained against these peptides, and we were able to characterize them by mass spectrometry. Starting from AAPCs encoding full length antigens from which these peptides are derived, peptide-specific CTLs were also obtained, but we were unable to characterize them by mass spectrometry. Therefore, highly immunogenic peptides, capable of stimulating strong anti-tumor cellular immune responses, may not be detected by mass spectrometry, rendering questionable the use of this technique for selecting clinically relevant peptides. In the second study, we started from predicted peptides. We were able to mount specific immune responses against FSP25 and FSP26 in silico predicted neoepitopes, derived from the CASP5 (-1) mutated protein found in 60% of microsatellite instability (MSI) colorectal cancer (CCR) patients. CASP5 is involved in programmed cell death and we have shown that MSI CRC patients whose tumors harbored this CASP5 (-1) mutation had less good prognosis. We have also shown that in HLA-A2+ MSI CASP5 (-1)-mutated CRC patients, specific CTLs could be obtained against FSP25 and FSP26 epitopes, capable of specifically lysing HLA-A2+ MSI CRC cell line HCT116 also harboring this mutation. Therefore, the mutated caspase-5 protein might be a therapeutic target of major interest for personalized specific immunotherapy strategies in the context of MSI CASP5 (-1)-mutated CRCs. In both studies, our AAPCs were a tool of choice for the development of personalized specific immunotherapy strategies, either for cellular adoptive approaches, to determine which antigens should be targeted or to directly activate and amplify in vitro antigen of interest-specific TLs which would be transferred in vivo, or for vaccine approaches, to identify the most immunogenic antigens which should be included in an efficacious vaccine
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017NORMR092 |
| Date | 17 January 2017 |
| Creators | Kora, Hafid |
| Contributors | Normandie, Frébourg, Thierry |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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