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Previous issue date: 2009-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The yeast Kluyveromyces lactis has a potential applicability as a host in biotechnological production of heterologous recombinant proteins of biotechnological interest. In this context the objective of this work was to express the protein of Leishmania major GDPase for biotechnology applied to human and canine leishmaniasis. The GDPase of L. major belongs to the family of E-NTPDases or apirases, proteins involved in infectivity and virulence of parasites. For a system of expression and secretion of heterologous proteins in K. lactis, the technique of polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify a sequence of 2073 bp covering the complete coding region of the GDPase "of L. major, which is inserted into the amplicon plasmid pKLAC1 sites in Sal I and Bgl II.The construction pKLAC1- GDPase was confirmed by PCR, linearized by the enzyme Ahd I and used for transformation of wild strain CBS 2359. The transformants were selected in YCB medium containing 5 mM acetamide induced in batch and in YPGal. Extract and supernatant of these cultures were analyzed by SDS-PAGE and Western blot using a polyclonal antiserum anti-GDPase of L. major. The analysis revealed a single protein of approximately 120 kDa in the wild strains and transformants of K. lactis. Perform a search in GenBank are two homologous genes in the genome of yeast: KlGDA1 and KlYND1que may explain the cross-reactivity. The results point to the failure to obtain transformants producing GDPase of L. major, probably due not to reconstitute the promoter PLAC4 that would direct the expression of the gene of GDPase. But that raises the chances of a wild strain to be tested as to induce the production of antibodies against species of the genus Leishmania and signal that the system contains flaws that compromise its use due to the dependence of reconstitution of the promoter PLAC4. / A levedura Kluyveromyces lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica
como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse
biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de
Leishmania major em K. lactis para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e
canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas
envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. A técnica da Reação da Polimerase em
Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma seqüência de 2073 pb referente a região
codificante completa da GDPase de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo
pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR,
linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem de K. lactis
CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5 mM de
acetamida e cultivados sob condições de indução em batelada em meio YPGal. Extrato e
sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um
anti-soro policlonal anti-GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de
cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Pesquisa no Genbank
revelou a presença de dois genes homólogos a GDPase no genoma da levedura: KlGDA1 e
KlYND1que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados demonstram que os
transformantes obtidos não produzem a GDPase de L. major, provavelmente devido a não
reconstituição do promotor PLAC4 que dirigiria a expressão do gene da GDPase. Porém levanta
as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de
anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém
falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor PLAC4.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/5312 |
| Date | 21 August 2009 |
| Creators | Santos, Yaro Luciolo dos |
| Contributors | Fietto, Juliana Lopes Rangel, Queiroz, Marisa Vieira de, Passos, Flávia Maria Lopes, Fietto, Luciano Gomes, Paula, Sérgio Oliveira de |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa, Mestrado em Microbiologia Agrícola, UFV, BR, Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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