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Previous issue date: 2008 / Variações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The observed changes in clinical features of leishmaniasis in humans and mice suggest the existence of a specie-dependent differentiation in Leishmania ability to cause lesions on host. The search of factors that differentiate Leishmania species regarding their virulence is very important to the comprehension of the mechanisms underlying the grade of damage that these parasites may cause to the host, enabling the discovery of new tools with therapeutic potential against leishmaniasis. Components of extracellular ATP metabolism pathway are emerging candidates to determine the virulence of these parasites, since ATP and adenosine, a product of AMP hydrolysis, are able to influence the immunological response of the host and, in consequence, the parasite establishment. This hypothesis is supported by the fact that Leishmania parasites need to use the salvation pathway of purine nucleotides by the action of enzymes, amongst them the apyrases, over extracellular ATP, which display immunestimulatory features, to produce adenosine, a product of AMP hydrolysis by the action of 5’-nucleotidases, whose importance to the parasite metabolism and to the regulation of the immune response has been described in literature. In order to verify this hypothesis, we use three Leishmania species with different degrees of virulence in C57BL/6 mice: the more virulent L. amazonensis and its counterparts L. braziliensis and L. major species. Initially, metacyclic and procyclic promastigotes from these parasites were evaluated regarding their ability in hydrolyze ATP, ADP and AMP. L. amazonensis infective metacyclic forms showed higher hydrolytic ability to the three analyzed nucleotides, when compared to the other two less virulent species. Moreover, its ability to hydrolyze ATP was higher than that from procyclic forms deriving from the same specie, suggesting a metacyclogenesis-dependent control of ATPase expression. Later, using RT-PCR and Western blotting analysis, we observed that, in spite of the occurring expression of mRNA to soluble and membrane-bound apirase isoforms from metacyclic promastigotes in the three species, only enriched membrane extracts from L. amazonensis were capable to react with T. cruzi anti-apyrase antibody. The inoculum of metacyclic promastigotes of this parasite in the presence of suramin, an ecto-ATPase inhibitor, in C57BL/6 mice, lead to a decrease in lesion size 4 weeks of infection onward and in parasitism 7 weeks after infection. Otherwise, the induction of higher 5’-nucleotidasic activity of the parasites or the simultaneous administration of adenosine in the inoculum lead to a transient increasing in lesion size and increased tissue parasitism 3 or 4 weeks after the infection of the same strain of mice with L. braziliensis metacyclic promastigotes, opposite to the effects obtained after the treatment, at the moment of inoculum, with the A2B receptor antagonist MRS 1754. Together, these results suggest that the reduction in the levels of extracellular ATP by the action of enzymes expressed by the parasite and/or the increased levels of adenosine may contribute to the establishment of Leishmania parasites in the vertebrate host, indicating a possible target to future therapeutic interventions against leishmaniasis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/2553 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Silva, Eduardo de Almeida Marques da |
| Contributors | Afonso, Luís Carlos Crocco |
| Publisher | Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFOP, instname:Universidade Federal de Ouro Preto, instacron:UFOP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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