In this work, we used atomic force spectroscopy to obtain the elastic modulus of melanoma and keratinocytes fixed cells, with the purpose to determine the initial conditions for studies of confluente cultures of these cells in the future. The cell lines used were HaCaT cells and WM1366 melanoma cell, the last one is derived from a radial growth melanoma and both were analyzed, parental WM1366 cells (WM1366 shSCR cells) and galectin-3 silenced WM1366 cells (WM1366 shGal3). Cells were located and images of them were obtained by AFM contact mode under liquid conditions. Single force curves acquired in the central region of cells were used to determine the elastic modulus by the Hertzian contact model for the pyramidal tip, allowing to establish a comparison patter between cancer and normal cells. It was found that the melanoma cell (21.8 ± 0.5 kPa) exhibit smaller elastic modulus than keratinocytes cells (31.9 ± 0.4 kPa). For WM1366 shGal3 was found a elastic modulus of 16.1 ± 0.6 kPa, therefore, we found that for large indentation depth it is possible to distinguish between the same melanoma cell line, which represents general alterations in the organization of the cytoskeleton induced by the presence or absence of the galectin-3 protein. On the other hand, to detect local elastic modulus variations along the cell and to identify subcellular regions characterized by specific stiffness associated with local structures, we took elasticity maps in which a single force curve is acquired in each probe position. In order to interpret these maps, the cell was sliced into several different heights, curves of each height section were analyzed and represented in histograms, adjusted by the binomial distribution function. It was observed that the gradient of elastic modulus in cells from the nuclear region towards the cell periphery is more pronounced in cells devoid of galectin-3 than parental cells. The increased elastic modulus in the pericellular region of cells devoid of galectin-3 suggests that the organization of the extracellular matrix in these areas is different than those observed around HaCaT and shSCR WM1366 cells. / Neste trabalho, utilizamos espectroscopia de força atômica para obtenção do módulo elástico de células fixadas de melanoma e queratinócitos, com o objetivo de determinar as condições iniciais de estudos a serem realizados futuramente de culturas de células confluentes do mesmo tipo. As linhagem celulares utilizadas foram as células HaCaT e as células de melanoma WM1366, sendo a última derivada de um melanoma de crescimento radial sendo analisadas tanto as células parentais (células WM1366 shSCR) e as células WM1366 silenciadas com galectina-3 (WM1366 shGal3). As células foram localizadas e imageadas no modo AFM contato em meio líquido. Curvas de força adquiridas na região central das células foram utilizadas para determinar o módulo elástico, a partir do modelo de contato hertziano por uma ponta piramidal, permitindo estabelecer um padrão para comparação entre células normais e cancerígenas. Verificou-se que a célula de melanoma exibe menor módulo de elasticidade (21.8 ± 0.5 kPa) do que as células de queratinócitos (31.9 ± 0.4 kPa). Para as células WM1366 shGal3 foi encontrado um módulo elástico de 16.1 ± 0.6 kPa. Portanto, verificou-se que, para grandes profundidades de indentação, é possível distinguir entre a mesma linhagem de melanoma, células que apresentam alterações gerais na organização do citoesqueleto induzidas pela presença ou ausência da proteína galectina-3. Por outro lado, para detectar variações locais do módulo elástico ao longo da célula e identificar regiões subcelulares, caracterizadas por rigidez específica associada a estruturas locais, foram obtidos mapas de elasticidade nos quais uma única curva de força é adquirida em cada posição da sonda. Para interpretar estes mapas, a célula foi dividida em regiões de diferentes alturas e curvas de cada seção de altura foram analisadas e representadas em histogramas, ajustadas pela função de distribuição binomial. Observou-se que o gradiente de módulo de elasticidade em células da região nuclear em direção à periferia celular é mais acentuado em células desprovidas de galectina-3 do que em células parentais. O aumento do módulo de elasticidade na região pericelular das células desprovidas de galectina-3 sugere que a organização da matriz extracelular nestas áreas é diferente das observadas em torno das células HaCaT e shSCR WM1366.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22042019-094701 |
| Date | 21 March 2019 |
| Creators | Reinoza, Nataly Zaribeth Herrera |
| Contributors | Salvadori, Maria Cecilia Barbosa da Silveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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