Orientadores: Ana Terezinha Guillaumon, Maria Beatriz Puzzi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:02:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bosnardo_CarlaAparecidaFaccio_D.pdf: 1290843 bytes, checksum: bad65c993cc70377c548424ff8f543bc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Introdução: A úlcera venosa é uma complicação da insuficiência venosa crônica, atinge indivíduos adultos, afastando-os do trabalho e do convívio social normal. Objetivo: Demonstrar uma nova terapêutica para o tratamento das úlceras venosas através do enxerto de queratinócitos autólogos. Casuística e Método: Foram selecionados, de forma aleatória no ambulatório de Moléstias Vasculares Periféricas da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP - Vinte e Cinco ( 25) doentes com úlcera de venosa, CEAP 6 , que não obtiveram cicatrização, das mesmas, com tratamentos convencionais; divididos em dois grupos, Grupo I- 11 doentes, 10 mulheres e 1 homem; Grupo II- 14 doentes, 11 mulheres e 3 homens. Ambos os grupos foram submetidos à aplicação do autoenxerto de queratinócitos sobre o leito limpo da úlcera; e ao grupo II, foi também ministrada dose de diosmina hesperidina micronizada a cada 12 horas. A todos os doentes, foi solicitado um repouso de 30 minutos em Trendelemburg para duas horas de atividade habitual. Os queratinócitos foram cultivados no Laboratório de Cultura de Células da Pele, CIPED- FCM - UNICAMP. Resultados: Após a aplicação de testes estatísticos não paramétricos, devido ao tipo da amostra, foi observada cicatrização e/ou melhora das úlceras com redução do leito nos dois grupos, sendo que o Grupo II obteve resultados mais precoces. Conclusão . Esse método mostra ser uma boa opção terapêutica no auxílio à cicatrização das úlceras venosas / Abstract: The venous stasis ulcer is the most severe complication of venous insufficiency, affecting adults and keeping them away from work and from normal social life. Objective: To demonstrate a new therapeutic method for accelerating healing. Methods: Twenty-five (25) patients with venous stasis ulcers, CEAP VI, who have not healed with conventional treatments were selected from the Clinic of Peripheral Vascular Diseases, Faculty of Medical Sciences, UNICAMP - were treated with autograft keratinocytes, grown in the skub cell culture laboratory, CIPED-FCM - UNICAMP. They were divided into two groups, Group I-11 patients, 10 female and male, Group II-14 patients, 11 female and 3 male. Both groups were treated with autograft keratinocytes on the clean ulcer bed, and group II, was also given a dose of micronized diosmin hesperidin every 12 hours. All the patients were asked to take a 30-minute rest in the Trendelenburg position for two hours of usual activity. Results: After the evaluation of data with statistics methods no parametric Healing and/or improvement of the ulcers with significant reduction of the bed in both groups were observed, with Group II obtaining precocious results. Conclusion? This method proves to be a good therapeutic option to help in the healing of stasis ulcers / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

A incidência de neoplasias tem aumentado expressivamente nos últimos anos e o contínuo crescimento populacional, bem como seu envelhecimento, aumentará de forma significativa a estatística desta enfermidade nas doenças mundiais. O tratamento das neoplasias geralmente consiste do uso singular ou combinado entre a quimioterapia, cirurgia e radioterapia dependendo da etiologia do tumor. Nos casos onde a radioterapia é empregada, além dos efeitos terapêuticos da radiação, podem ocorrer complicações específicas e, na pele, estas complicações podem se apresentar com uma expressão clínica que varia desde o eritema cutâneo até a radionecrose, sendo este ultimo o efeito adverso com maior gravidade. O tratamento para a radionecrose consiste no desbridamento das áreas necróticas e recobrimento do leito cirúrgico. Os enxertos autólogos são mais comumente usados para este recobrimento, entretanto quando grandes áreas são afetadas, os aloenxertos são uma alternativa de tratamento oclusivo e ainda, com a adição de queratinócitos e células mesenquimais derivadas da gordura (ADSC), torna-se uma alternativa por seu conhecido papel imunomodulatório e regenerativo. Neste sentido, visando simular os efeitos adversos da radionecrose, foi criado um modelo animal de radionecrose cutânea induzida em camundongos Nude (Nu/Nu) para o desenvolvimento de terapias regenerativas baseadas em substitutos dermoepidérmicos humanos contendo, queratinócitos e ADSC, que se mostrou eficiente como tratamento oclusivo. Além disso, com este modelo animal de radionecrose estabelecido, novas possibilidades de tratamento de enfermidades envolvendo regeneração cutânea, podem ser testadas. / The neoplasms incidence has increased significantly in recent years and continued population growth and aging will increase the statistics of this illness in the world\'s diseases. The cancer treatment usually consists in individual or combined use of chemotherapy, surgery and radiotherapy depending on the etiology of the tumor. In cases where radiotherapy is used in addition to the therapeutic effects of radiation, specific complications can occur, and in the skin, these complications can be present with a clinical expression ranging from erythema to radionecrosis, and this latter being the adverse effect with greater severity. The radionecrosis treatment consists in debridementing necrotic areas and covering the surgical wounds. Autologous grafts are most commonly used for this covering, however when large areas are affected, allografts can be used for occlusive treatment and the keratinocytes and adipose derived stem cells (ADSC) addition becomes an alternative, due to the knowing for immunomodulatory and regenerative response. For that reason, aiming to simulate the radionecrosis adverse effects, an animal model of induced cutaneous radionecrosis was created, in athymic mouse Nude (Nu/Nu), for developing regenerative therapies based on human dermal-epidermal substitutes containing keratinocytes and ADSC, which proved occlusive as an efficient treatment, furthermore, having this radionecrosis animal model established, new possibilities for treatment of diseases involving dermal regeneration, can be tested.

In this work, we used atomic force spectroscopy to obtain the elastic modulus of melanoma and keratinocytes fixed cells, with the purpose to determine the initial conditions for studies of confluente cultures of these cells in the future. The cell lines used were HaCaT cells and WM1366 melanoma cell, the last one is derived from a radial growth melanoma and both were analyzed, parental WM1366 cells (WM1366 shSCR cells) and galectin-3 silenced WM1366 cells (WM1366 shGal3). Cells were located and images of them were obtained by AFM contact mode under liquid conditions. Single force curves acquired in the central region of cells were used to determine the elastic modulus by the Hertzian contact model for the pyramidal tip, allowing to establish a comparison patter between cancer and normal cells. It was found that the melanoma cell (21.8 ± 0.5 kPa) exhibit smaller elastic modulus than keratinocytes cells (31.9 ± 0.4 kPa). For WM1366 shGal3 was found a elastic modulus of 16.1 ± 0.6 kPa, therefore, we found that for large indentation depth it is possible to distinguish between the same melanoma cell line, which represents general alterations in the organization of the cytoskeleton induced by the presence or absence of the galectin-3 protein. On the other hand, to detect local elastic modulus variations along the cell and to identify subcellular regions characterized by specific stiffness associated with local structures, we took elasticity maps in which a single force curve is acquired in each probe position. In order to interpret these maps, the cell was sliced into several different heights, curves of each height section were analyzed and represented in histograms, adjusted by the binomial distribution function. It was observed that the gradient of elastic modulus in cells from the nuclear region towards the cell periphery is more pronounced in cells devoid of galectin-3 than parental cells. The increased elastic modulus in the pericellular region of cells devoid of galectin-3 suggests that the organization of the extracellular matrix in these areas is different than those observed around HaCaT and shSCR WM1366 cells. / Neste trabalho, utilizamos espectroscopia de força atômica para obtenção do módulo elástico de células fixadas de melanoma e queratinócitos, com o objetivo de determinar as condições iniciais de estudos a serem realizados futuramente de culturas de células confluentes do mesmo tipo. As linhagem celulares utilizadas foram as células HaCaT e as células de melanoma WM1366, sendo a última derivada de um melanoma de crescimento radial sendo analisadas tanto as células parentais (células WM1366 shSCR) e as células WM1366 silenciadas com galectina-3 (WM1366 shGal3). As células foram localizadas e imageadas no modo AFM contato em meio líquido. Curvas de força adquiridas na região central das células foram utilizadas para determinar o módulo elástico, a partir do modelo de contato hertziano por uma ponta piramidal, permitindo estabelecer um padrão para comparação entre células normais e cancerígenas. Verificou-se que a célula de melanoma exibe menor módulo de elasticidade (21.8 ± 0.5 kPa) do que as células de queratinócitos (31.9 ± 0.4 kPa). Para as células WM1366 shGal3 foi encontrado um módulo elástico de 16.1 ± 0.6 kPa. Portanto, verificou-se que, para grandes profundidades de indentação, é possível distinguir entre a mesma linhagem de melanoma, células que apresentam alterações gerais na organização do citoesqueleto induzidas pela presença ou ausência da proteína galectina-3. Por outro lado, para detectar variações locais do módulo elástico ao longo da célula e identificar regiões subcelulares, caracterizadas por rigidez específica associada a estruturas locais, foram obtidos mapas de elasticidade nos quais uma única curva de força é adquirida em cada posição da sonda. Para interpretar estes mapas, a célula foi dividida em regiões de diferentes alturas e curvas de cada seção de altura foram analisadas e representadas em histogramas, ajustadas pela função de distribuição binomial. Observou-se que o gradiente de módulo de elasticidade em células da região nuclear em direção à periferia celular é mais acentuado em células desprovidas de galectina-3 do que em células parentais. O aumento do módulo de elasticidade na região pericelular das células desprovidas de galectina-3 sugere que a organização da matriz extracelular nestas áreas é diferente das observadas em torno das células HaCaT e shSCR WM1366.

A incidência de neoplasias tem aumentado expressivamente nos últimos anos e o contínuo crescimento populacional, bem como seu envelhecimento, aumentará de forma significativa a estatística desta enfermidade nas doenças mundiais. O tratamento das neoplasias geralmente consiste do uso singular ou combinado entre a quimioterapia, cirurgia e radioterapia dependendo da etiologia do tumor. Nos casos onde a radioterapia é empregada, além dos efeitos terapêuticos da radiação, podem ocorrer complicações específicas e, na pele, estas complicações podem se apresentar com uma expressão clínica que varia desde o eritema cutâneo até a radionecrose, sendo este ultimo o efeito adverso com maior gravidade. O tratamento para a radionecrose consiste no desbridamento das áreas necróticas e recobrimento do leito cirúrgico. Os enxertos autólogos são mais comumente usados para este recobrimento, entretanto quando grandes áreas são afetadas, os aloenxertos são uma alternativa de tratamento oclusivo e ainda, com a adição de queratinócitos e células mesenquimais derivadas da gordura (ADSC), torna-se uma alternativa por seu conhecido papel imunomodulatório e regenerativo. Neste sentido, visando simular os efeitos adversos da radionecrose, foi criado um modelo animal de radionecrose cutânea induzida em camundongos Nude (Nu/Nu) para o desenvolvimento de terapias regenerativas baseadas em substitutos dermoepidérmicos humanos contendo, queratinócitos e ADSC, que se mostrou eficiente como tratamento oclusivo. Além disso, com este modelo animal de radionecrose estabelecido, novas possibilidades de tratamento de enfermidades envolvendo regeneração cutânea, podem ser testadas. / The neoplasms incidence has increased significantly in recent years and continued population growth and aging will increase the statistics of this illness in the world\'s diseases. The cancer treatment usually consists in individual or combined use of chemotherapy, surgery and radiotherapy depending on the etiology of the tumor. In cases where radiotherapy is used in addition to the therapeutic effects of radiation, specific complications can occur, and in the skin, these complications can be present with a clinical expression ranging from erythema to radionecrosis, and this latter being the adverse effect with greater severity. The radionecrosis treatment consists in debridementing necrotic areas and covering the surgical wounds. Autologous grafts are most commonly used for this covering, however when large areas are affected, allografts can be used for occlusive treatment and the keratinocytes and adipose derived stem cells (ADSC) addition becomes an alternative, due to the knowing for immunomodulatory and regenerative response. For that reason, aiming to simulate the radionecrosis adverse effects, an animal model of induced cutaneous radionecrosis was created, in athymic mouse Nude (Nu/Nu), for developing regenerative therapies based on human dermal-epidermal substitutes containing keratinocytes and ADSC, which proved occlusive as an efficient treatment, furthermore, having this radionecrosis animal model established, new possibilities for treatment of diseases involving dermal regeneration, can be tested.

Submitted by Cristiane Chim (cristiane.chim@ucpel.edu.br) on 2017-02-15T13:44:21Z No. of bitstreams: 1 Tese Henrique Ribeiro Issacsson.pdf: 26423531 bytes, checksum: 842afd4c9c66fc82555f2eb9af20dd15 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T13:44:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Henrique Ribeiro Issacsson.pdf: 26423531 bytes, checksum: 842afd4c9c66fc82555f2eb9af20dd15 (MD5) Previous issue date: 2014-12-10 / We describe the case of a newborn with MEND, which presents in addition to the membrane collodium, polydactyly, Syndactyly, microphthalmia, corpus callosum agenesis, agenesis of vérmix Cerebellar, cerebellar hypoplasia, and Dandy Walker cyst. It was still Analysis by scanning electron microscopy Collagen membrane and genetic sequencing of the EBP gene. Is responsible for the encoding of the enopamil binding enzyme. In the electron microscopy findings, there was an intense Desquamation of corneocytes on the outer face of the collodic membrane, Nucleated corneocytes on the inner face, and several layers of Forming a thick membrane. The DNA test found New mutation in the EBP gene in exon 4 c.439C> T, p.R147C.New Cases need to be sought, and should be reported for the best Knowledge of this disease. / Descrevemos o caso de um recém-nascido portador da Síndrome de MEND, que apresenta além da membrana colódio, polidactilia, sindactilia, microftalmia, agenesia de corpo caloso, agenesia de vérmix cerebelar, hipoplasia cerebelar e cisto de Dandy Walker. Foi ainda realizada análise através de microscopia eletrônica de varredura da membrana colódio e sequenciamento genético do gene EBP, sendo este responsável pela codificação da enzima ligação do emopamil. Nos achados de microscopia eletrônica evidenciou-se intensa descamação de corneócitos na face externa da membrana colódio, além de corneócitos nucleados na face interna, e várias camadas de células formando uma membrana espessa. O exame do DNA localizou nova mutação no gene EBP no exon 4 c.439C>T,p.R147C.Novos casos necessitam ser buscados, e devem ser relatados para o melhor conhecimento desta doença.

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: Os queratinócitos são células presentes na epiderme, constituída pelo epitélio estratificado pavimentoso queratinizado. Estas células organizam-se em camadas de diferentes estágios de maturação celular (camada basal ou germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea) e tem a função de revestimento desses tecidos. Diversos estudos buscam elucidar e caracterizar tecidos hígidos de origem epitelial, como pele, olhos e casco, para que possam identificar os mecanismos de desenvolvimento de enfermidades nesses tecidos. O casco equino é formado por epiderme em diferentes estágios de queratinização, subdivididos em estrato externo ou parede do casco, estrato médio e estrato interno, nesse último estão localizadas as lâminas epidermais primárias (LEP) e secundárias (LES) onde os queratinócitos estão presentes junto a membrana basal (transição de epiderme e derme, junção que faz a adesão do casco com a falange distal). É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo, foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenient... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The keratinocytes are cells presented in the epidermis, constituted by the stratified keratinized squamous epithelium. These cells organized in layers of different stages of cell maturation (basal or germinative, prickly, granular, lucid and corneal layers) and have a tissue coating function. Several studies seek to elucidate and characterize healthy tissues of epithelial origin, such as skin, eyes and hoof, so that they can identify the mechanisms of development of diseases in these tissues. The equine hoof is composed of epidermis at different stages of keratinization, subdivided into external stratum, middle stratum and internal stratum, in which the primary epidermal lamellae (PEL) and secondary epidermal (SEL) are located and where keratinocytes are present along the basement membrane (Transition of the epidermis and dermis, which joins the hoof to the distal phalanx). It is evident the importance of the hoof health of horses, but the knowledge at the cellular level is poorly understood. Studies involving the culture of equine keratinocytes are scarce. The development of keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods are already established, such as for culture of skin keratinocytes, but few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The aim of this study was to standardize the cultivation of keratinocytes from equine hoof, aiming future associate with the study of regenerative medici... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002 / O presente estudo teve como objetivo verificar o efeito da Vitamina C em culturas de queratinocitos humanos submetidos a hipoxia gasosa, quanto a agressao celular e ao estresse oxidativo. O metodo constitui-se no isolamento e cultivo de queratinocitos humanos em 40 garrafas, que foram divididas em quatro grupos: controle, controle com vitamina C, hipoxia e hipoxia com vitamina C. Os queratinocitos foram submetidos a hipoxia por substituicao gasosa no interior das garrafas por uma mistura contendo 95 por cento de nitrogenio e 5 por cento de C02,durante 30 minutos. Foram avaliados a agressao celular atraves de dosagem DHL e o estresse oxidativo pela dosagem de MDA. Os resultados demonstraram que a hipoxia aumentou em cerca de 8 vezes a liberacao de DHL pelos queratinocitos e que a vitamina C foi eficaz em inibir esta agressao. Quanto a producao de radicais livres, a hipoxia dobrou os valores de MDA dos grupos controle, sendo que a vitamina C levou a um aumento de peroxidacao lipidica. Assim, concluimos que a vitamina C foi capaz de diminuir de maneira significante a agressao celular pela hipoxia, havendo entretanto piorado o estresse oxidativo (nao significante) / BV UNIFESP: Teses e dissertações

RIBEIRO, Natássia Albuquerque. Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas: formulação de géis e análise dos seus efeitos na cicatrização em experimentos in vivo e in vitro. 2016. 132 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-24T18:50:21Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_naribeiro.pdf: 3772754 bytes, checksum: 9edbe5008049af2b56383b60c8cd7b59 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-26T18:44:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_naribeiro.pdf: 3772754 bytes, checksum: 9edbe5008049af2b56383b60c8cd7b59 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-26T18:44:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_naribeiro.pdf: 3772754 bytes, checksum: 9edbe5008049af2b56383b60c8cd7b59 (MD5) Previous issue date: 2016 / The use of marine algae as potential tools for obtaining pharmaceuticals has shown a worldwide trend and has grown substantially over the last two decades. Bioactive Molecules obtained from seaweeds such as proteins, carbohydrates, phenolics, polyunsaturated fatty acids, terpenoids, etc. they showed numerous biological activities. Among these molecules, it highlights the sulfated polysaccharides from seaweed. This work aimed to evaluate the effect of the healing potential gels developed from sulfated polysaccharide of seaweed: Caulerpa racemosa (CrII), Cryptonemia crenulata (CcII) e Gracilaria birdiae (GbI), native of Ceará in healing in vivo and in vitro models. The sulfated polysaccharides were obtained by chromatographic procedure of ion exchange. The macromolecules obtained were evaluated in toxicological testing and analyzed for their potential to interfere in the central nervous system (CNS). Later, it was used in procoagulant in vitro/ex vivo and antibacterial activity experiments. Then the sulfated polysaccharides were used in the formulation of gels that were evaluated for their dermal irritant for 7 days, which was analyzed macroscopic skin reactions, skin thickness and the amount of exudate present in the tissue. The gels were applied to wounds in healthy mice induced by mechanical trauma and evaluated for their potential healing for 15 days. A histopathological evaluation was performed to prove the efficiency of the gels in the treatment of injuries. CcII was used in in vitro experiments where it was observed its potential adhesion, proliferation and cytotoxicity using HaCaT cells. Finally, CcII was evaluated in a 3D model of human skin equivalent (3D EPHS) for 7 days, which was analyzed parameters such as re-epithelialization area and lateral migration of keratinocytes. The results obtained showed that CrII, CcII and GbI present income 20.5%; 21.3% and 23.6%, respectively, and shown to be non-toxic and without CNS effects. In the coagulant test, CrII shown to be pro-coagulant and CcII showed anticoagulant activity in APTT assay in vitro. However, these activities have not been confirmed in the ex vivo assay. The GbI polysaccharide showed no anticoagulant and procoagulant activities in any of the assays tested. CrII, CcII and GbI showed no antibacterial activity against gram-negative and gram-positive bacteria. The gels formulated with CrII, CcII and GbI were not irritating in a skin irritation model in mice. And, when tested in wounds, only the gel formulated with CcII presented healing effect. Considering this fact, CcII was evaluated in experiments in vitro where it was not able to cause adherence, proliferation and cytotoxicity in HaCaT cells. CcII when analysed in the 3D EPHs model has a healing effect, accelerating the process of re-epithelization, and keratinocytes migrating. In view of the results obtained, CcII has a promising potential for formulating bioproduct with a healing activity. / A utilização de algas marinhas como ferramentas potenciais para a obtenção de produtos farmacêuticos tem se mostrado uma tendência mundial e cresceu substancialmente nas duas últimas décadas. Moléculas bioativas obtidas a partir de algas marinhas tais como proteínas, carboidratos, compostos fenólicos, ácidos graxos poliinsaturados, terpenóides etc. possuem inúmeras atividades biológicas. Dentre essas moléculas, destacam-se os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do potencial cicatrizante de géis desenvolvidos à base de polissacarídeos sulfatados das algas marinhas: Caulerpa racemosa (CrII), Cryptonemia crenulata (CcII) e Gracilaria birdiae (GbI), nativas do litoral cearense em modelos de cicatrização in vivo e in vitro. Os polissacarídeos sulfatados foram obtidos por procedimento cromatográfico de troca iônica. As macromoléculas obtidas foram avaliadas em ensaio toxicológico e analisadas quanto ao seu potencial de interferir no sistema nervoso central (SNC). Posteriormente foram utilizadas em experimentos de atividades pró-coagulante in vitro/ex vivo e antibacteriana. Em seguida os polissacarídeos sulfatados foram utilizados na formulação de géis que foram avaliados quanto à sua irritabilidade dermal durante 7 dias, onde foi analisado as reações dermatológicas macroscópicas, espessura da pele e o valor de exsudato presente no tecido. Os géis foram aplicados em feridas induzidas em camundongos sadios por trauma mecânico e avaliados quanto ao seu potencial cicatrizante durante 15 dias. Uma avaliação histopatológica foi realizada para comprovação da eficiência dos géis no tratamento das lesões. CcII foi utilizado em experimentos in vitro onde foi observado o seu potencial de aderência, proliferação e citotoxicidade utilizando células HaCaT. E por fim, CcII foi avaliado em um modelo 3D de equivalentes de pele humana (3D EPHs) durante 7 dias, onde foi analisado parâmetros como área de re-epitelização e migração lateral dos queratinócitos. Os resultados observados demonstraram que CrII, CcII e GbI apresentaram rendimentos de 20,5%; 21,3% e 23,6%, respectivamente, e mostraram-se atóxicos e sem efeitos sobre o SNC. No ensaio de atividade pró-coagulante CrII demonstrou ser pró-coagulante e CcII apresentou atividade anticoagulante no ensaio do APTT in vitro. Entretanto, estas atividades não foram confirmadas no ensaio ex vivo. O polissacarídeo de GbI não apresentou atividades anticoagulante e pró-coagulante em nenhum dos ensaios testados. CrII, CcII e GbI não apresentaram atividade antibacteriana frente às bactérias gram-negativa e gram-positiva. Os géis formulados com CrII, CcII e GbI não se mostraram irritantes em um modelo de irritação cutânea em camundongos. E quando testados em feridas, apenas o gel formulado com CcII apresentou efeito cicatrizante. Diante deste fato, CcII foi avaliada em experimentos in vitro, em que, não foi capaz de provocar a aderência, proliferação e citotoxidade em células HaCaT. CcII quando analisada no modelo 3D EPHs apresentou um efeito cicatrizante, acelerando o processo de re-epitelização e migração dos queratinócitos. Tendo em vista os resultados obtidos, CcII apresenta um potencial para formulação de um bioproduto promissor com uma função de cicatrização.

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:10:09Z No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-sarita-mac-cornick.pdf: 659699 bytes, checksum: 5c4138f441b6bac0c9d0132808e8fa60 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:10:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-sarita-mac-cornick.pdf: 659699 bytes, checksum: 5c4138f441b6bac0c9d0132808e8fa60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T13:10:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-sarita-mac-cornick.pdf: 659699 bytes, checksum: 5c4138f441b6bac0c9d0132808e8fa60 (MD5) Previous issue date: 2015 / INTRODUÇÃO: A queimadura extensa pode evoluir com infecção grave e sepse com aumento da morbidade e mortalidade. Ocorre um estado contínuo de inflamação e o nível sérico de citocinas é elevado. Os receptores do tipo Toll-Like são importantes receptores de células do sistema imune inato que reconhecem antígenos. Portanto, existe a necessidade da obtenção de perfil da expressão gênica da pele em queimaduras extensas para análise inicial. OBJETIVO: Avaliar o perfil de expressão de genes relacionados às vias de receptores Toll-Like em amostras de cultura primária de queratinócitos humanos epidérmicos de pacientes com queimadura grave. MÉTODOS: Após a obtenção de fragmentos de pele viáveis com e sem queimadura, a cultura de queratinócitos foi iniciada pelo método enzimático utilizando dispase (Sigma-Aldrich) e Tripsina (Sigma-Aldrich). Após o estabelecimento da linhagem celular, estas células foram tratadas com QIAzol Reagent® (Qiagen) para a extração de RNA total. Este foi quantificado e analisado quanto à pureza para se obter cDNA para a análise da expressão de 84 genes específico de vias TLR de placas de PCR Arrays (SA Biosciences). RESULTADOS: Após a análise da expressão dos genes verificou-se que 21% destes genes estavam expressos diferencialmente, dos quais 100% foram reprimidos ou hiporregulados. Dentre estes, os seguintes genes (vezes de diminuição): HSPA1A (-58), HRAS (-36), MAP2K3 (-23), TOLLIP (-23), RELA (-18), FOS (-16), e TLR1 (-6,0). CONCLUSÃO: O perfil da expressão gênica da pele de pacientes com grande queimadura mostrou 21% de genes alterados, destes 100% apresentaram-se hiporregulados. / INTRODUCTION: Large burn injury can progress to severe infection and sepsis with increased morbidity and mortality. There is a continuous state of inflammation and serum levels of cytokines are high. The Toll-like receptors are important receptors of the innate immune system that recognize antigens. Therefore, a need exists for obtaining the gene expression profile of the skin of extensive burns for initial analysis. PURPOSE: To evaluate the expression profile of genes related to Toll Like Receptors (TLR) pathways of human primary epidermal keratinocytes (hKEp) of patients with severe burns. METHODS: After obtaining viable fragments of skin with and without burn injury, culture hKEp was initiated by the enzymatic method using Dispase (Sigma-Aldrich) and Trypsin (Sigma-Aldrich). These cells were treated with Trizol® (Life Technologies) for extraction of total RNA. This was quantified and analyzed for purity for obtaining cDNA for the analysis of gene expression using specific TLR pathways PCR Arrays plates (SA Biosciences). RESULTS: After the analysis of gene expression we found that 21% of these genes were differentially expressed, of which 100% were repressed or hyporegulated. Among these, the following genes (fold decrease): HSPA1A (-58), HRAS (-36), MAP2K3 (-23), TOLLIP (-23), RELA (-18), FOS (-16), and TLR1 (-6.0). CONCLUSION: The gene expression profile of skin of patients with large burn injury showed 21% altered genes, and 100% of them were downregulated.

RAS é a oncoproteína mutada mais encontrada em tumores sólidos, o que mostra seu grande potencial transformador. Não obstante, células que carregam essa mutação apresentam estresse oncogênico gerado por excessiva sinalização mitogênica, o que direciona preferencialmente as células portadoras para a morte em detrimento da transformação maligna. Basicamente a transformação direcionadapela proteína RAS mutada age sinergicamente com deficiência em supressores de tumor para evitar o destino celular preferencial frente ao estresse oncogênico. Este é o caso da interação observada entre HRASG12V e E6E7 de HPV, sendo que a infecção pelo vírus aparentemente é condição necessária em cânceres cervicais e muito presente em cânceres de cabeça e pescoço. A sinergia entre HRASG12V e queratinócitos imortalizados por E6E7 desequilibra o balanço homeostático entre subsistemas pró-morte, devido ao estresse oncogênico, ou pró-sobrevivência, que garante viabilidade por meio de novos padrões de robustez celular. Em ambos os casos, o processo que gera uma célula transformada, ou as elimina pelo caminho, apresenta pistas de vulnerabilidades às quais os queratinócitos são expostos uma vez que carreguem tal combinação de fatores. Apresentamos nesse trabalho os principais atores que compõem o estresse oncogênico deletério desencadeado pela atividade de HRASG12V: estresse mitogênico, replicativo e oxidativo; todos eles são responsáveis por provocar dano no DNA, que por sua vez promove parada no ciclo celular até que as células não possam mais suportar tamanha injúria, o que acaba levando-as maciçamente a morte. Mostramos que a alta intensidade mitogênica gerada pela atividade de HRASG12V provoca um desequilíbrio metabólico que leva ao aumento de espécies oxidantes e ao estresse replicativo. Todavia, um tratamento exógeno com o antioxidante NAC restaurou parcialmente a proliferação celular assim como a sobrevivência, agindo como um amenizador do dano no DNA gerado pelas espécies oxidantes. Já uma suplementação com nucleosídeos exógenos restaurou fortemente a sobrevivência celular, sugerindo que o desequilíbrio metabólico pode estar agindo no pool de nucleotídeos, o que poderia ser uma das causas do estresse replicativo. Como mecanismo intrínseco de sobrevivência, a autofagia se intensifica em resposta ao desequilíbrio sistêmico desencadeado pela atividade de HRASG12V. Por meio de sublinhagens defectivas para autofagia, mostramos que o processo retarda o aparecimento de espécies oxidantes, além de evitar sua elevação a níveis ainda mais drásticos, o que consequentemente ameniza o dano no DNA observado. Além disso, hipotetizamos que o processo poderia também estar contribuindo fortemente para a reciclagem de substratos básicos tais como nucleotídeos, assim acarretando em menor estresse replicativo. Na literatura atual, debate-se a noção de que, dependendo do contexto celular, a autofagia poderia promover tanto morte celular como transformação maligna. Entretanto, nesta tese mostramos que, na interação entre queratinócitos, E6E7 e HRASG12V, a autofagia é um mecanismo pró-sobrevivência: se por um lado a demanda autofágica é recrutada além de sua capacidade de processamento, fazendo com que seu fluxo seja bloqueado, por outro a eliminação do sistema se torna demasiadamente deletério, direcionando as células expostas ao estresse oncogênico causado pela atividade de HRASG12V necessariamente à morte. / Mutated RAS is the oncoprotein most found in solid tumors, which shows its huge tumorogenic potential. Despite of that, mutated RAS triggers a strong oncogenic stress, which very often drives cells to death instead of malignant transformation. Basically, the success of the Ras malignant transformation driving activity depends on a synergy between that mutated protein and inhibition of tumor suppression genes. This is the case of the interaction between HRASG12V and E6E7 proteins of HPV: It seems that HPV infection is an initial necessary condition for cervical cancer development and is also very frequent in head and neck carcinomas. The synergy between HRASG12V and E6E7, in pre-malignant keratinocytes, imbalances the homeostasis between pro-death subsystems, due oncogenic stress, and pro-survival subsystems that ensure new patterns of cellular robustness. In both cases, the process responsible for generating a malignant transformed cell or, more frequently, eliminating those cells carrying the combined characteristics, exposes the keratinocytes vulnerabilities. We showed in this work that the main actors of deleterious oncogenic stress triggered by HRASG12V activity are: Mitogenic, replicative and oxidative stresses; all of them induce DNA damage, hence cell cycle arrests until the cell cannot resist such injury any further, which leads to massive cell death. The intense mitogenic activity triggered by HRASG12Vcauses metabolic imbalance, which is responsible for an increase of oxidative species and replicative stress levels; the exogenous treatment with antioxidant NAC partially restored cell growth and cell survival, acting as a softener of the DNA damage caused by oxidative species. On the other hand, nucleoside supplementation strongly restored cell survival, suggesting that the aforementioned metabolic imbalance might be acting in the pool of nucleotides, hence it might be a possible cause of replicative stress. As an intrinsic survival mechanism, the autophagy is intensified in response to systemic imbalance triggered by HRASG12V activity. Through the autophagy defective subline, we showed that that mechanism both delays the increase of oxidative species and avoids their elevation to catastrophic highlevels. Furthermore, autophagy could strongly contribute to the recycling of basic substrates such as nucleotides, which might be mitigating the replicative stress. Nowadays, there is a debate on the role of autophagy promoting either malignant transformation or cell death depending on metabolic context. In this work, we showed an instance of the interaction between E6E7 and HRASG12V triggering autophagy pro-survival mechanisms and hence increasing general cell viability