O câncer não-melanoma corresponde a 25% de todos os tumores e é caracterizado por uma neoplasia dos queratinócitos. Evidências mostram que a resistência a apoptose é uma das características para o surgimento e evolução dos tumores malignos. A proposta deste trabalho foi estudar quais funções as moléculas BIM, PUMA e Fas desempenham nos queratinócitos quando submetidas à transformações celulares, como UVB e DMBA, e indutores de apoptose. Para isso foi estabelecido cultura primaria de queratinócitos de neonatos das linhagens C57Bl/6 WT; PUMA KO; LPR. As células foram tratadas com AD, VP-16, CHX, UVB e DMBA in vitro. Observamos a expressão de Bid, Bim, Bax no tratamento com UVB. Avaliamos o perfil de desenvolvimento do tumor nesses animais utilizando um modelo de tumorigenese química in vivo. Os queratinócitos deficientes em PUMA e Fas se comportam de maneira semelhante no tratamento com quimioterápicos, no entanto, no tratamento com carcinógenos a molécula Fas desempenha um papel mais relevante na indução de morte celular e no desenvolvimento da carcinogênese. / The non-melanoma cancer accounts for 25% of all tumors and is characterized by a neoplasm of keratinocytes. Evidence shows that apoptosis resistance is one of the characteristics for the emergence and development of malignant tumors. The This study investigated what roles the BIM, PUMA and Fas molecules play in keratinocytes when subjected to cell transformations, such as UVB and DMBA, and apoptosis inducers. For this, keratinocytes primary culture was established from neonatal skin to C57BL / 6 WT; PUMA KO; LPR. The cells were treated with AD, VP-16, CHX, UVB and DMBA in vitro. We observed the expression of Bid, Bim, Bax in treatment with UVB. We evaluated tumor development profile in these animals using a model of chemical tumorigenesis in vivo. PUMA-deficient keratinocytes and Fas mutant have similarly behave in chemotherapy treatment, however, Fas molecule plays a more important role in the induction of cell death with the treatment with carcinogens in the development and carcinogenesis.

Epitélios confluentes de queratinócitos autólogos, cultivados segundo metodologia padronizada por Rheinwald e Green em 1975, têm sido usados como enxertos em diferentes situações clínicas. Contudo, a presença de componentes xenobióticos empregados nesta metodologia implica na possibilidade de transmissão de zoonoses, príons e viroses aos pacientes, além de envolver questões éticas relacionadas à utilização de animais. Tais preocupações têm direcionado pesquisadores a buscar alternativas que superem este impasse; no entanto, as formulações obtidas até o momento não são completamente satisfatórias. Assim, nossa proposta neste estudo, foi omitir ou substituir os componentes xenobióticos tradicionalmente utilizados no meio para queratinócitos, por similares humanos. Como resultado, padronizamos um meio de cultura onde omitimos o emprego de toxina colérica, substituímos o soro fetal bovino por lisado de plaquetas humanas na concentração de 2,5% e a insulina de origem bovina foi substituída por insulina recombinante humana na mesma concentração do método original (5 μg/mL). Com os resultados obtidos foi possível concluir ser viável o cultivo de queratinócitos humanos, mantidos em meio de cultura livre de componentes xenobióticos. / Confluent epithelia of autologous keratinocytes, cultivated according to standardized methodology by Rheinwald and Green in 1975, have been used as grafts in different clinical situations. However, the presence of xenobiotics components applied in this method implies the possibility of transmission of zoonoses, príons, and viruses to patients, besides involving ethical issues related to the use of animals for components obtainment. Such concerns have driven researchers to seek alternatives that overcome this deadlock, as the formulations obtained so far are not completely satisfactory. Thus, our proposal in this study was to omit or replace the xenobiotics components traditionally used in the medium to keratinocytes culture, by human similar. As a result, we have standardized a culture medium whereby we omitted the use of cholera toxin, replaced fetal bovine serum by human platelet lysate at a 2.5% concentration and bovine insulin was replaced by recombinant human insulin at the same concentration as the original method (5 μg/mL). With the results obtained we could conclude that the method to be viable to cultivate human keratinocytes, kept in culture medium free of xenobiotics components.

Freqüentemente as condutas terapêuticas utilizadas no tratamento de patologias bucais são cirúrgicas, resultando em falhas de continuidade da mucosa bucal. A possibilidade de obtenção de epitélios transplantáveis, a partir do cultivo in vitro de células da mucosa bucal, abre novas perspectivas de utilização, não se restringindo somente ao seu local de origem, ou seja, a boca, mas também como material de reconstrução para outras regiões, tais como: uretra, córnea, superfície ocular e epitélio córneo-limbal. Os métodos utilizados para a obtenção dessas células ainda são controversos na literatura. Neste sentido, avaliamos e comparamos a eficiência de dois métodos, enzimático e explante, para a obtenção de queratinócitos de mucosa bucal humana. Os fragmentos utilizados para a obtenção dessas células foram obtidos durante procedimentos cirúrgicos de pacientes voluntários saudáveis. Os queratinócitos foram cultivados sobre uma camada de sustentação, feeder-layer, confeccionada com fibroblastos murinos irradiados (3T3 - Swiss albino). Neste estudo foram comparados: o tempo para a obtenção dos queratinócitos, o rendimento obtido entre os dois métodos, a duração da vida útil em cultura, a capacidade que estas células tiveram em formar um epitélio in vitro e a morfologia dos mesmos. Os resultados obtidos, na avaliação dos dois métodos, comprovaram a possibilidade de obtenção dos queratinócitos, a partir de um pequeno fragmento bucal, porém pode-se verificar que existem vantagens e restrições peculiares a cada um dos métodos estudados. / The therapeutic procedures frequently used in oral treatments for the pathological diseases are surgical, resulting in failures of the mucosal continuity.The possibility to obtain transplantable oral epithelia from an in vitro cell culture opens new utilization perspectives not only to where it comes from, but also as a reconstructive matherial for other parts of the human body, such as: urethra, epithelia corneo-limbal, cornea, ocular surface. Many researchers still use controversial methods for obtaining cells. It was therefore evaluated and compared the efficiency in both methods: enzimatic and direct explant to obtain oral keratinocytes from human oral mucosa. Fragments of intra oral epithelial tissues from healthy human subjects, undergoing dental surgeries, were donated to the research project. The keratinocytes were cultivated over a feeder-layer from a previously irradiated 3T3 Swiss albino fibroblasts. In this study it was compared the time needed in the cell obtaintion, the best cell amount between both methods, the life-span, the cell capacity to form an in vitro epithelia and its morphologic structure. The results in the accessment of both methods have shown the possibility to obtain keratinocytes from a small oral fragment, but at the same time we may verify the advantages and peculiar restrictions for each one of both analyzed methods.

Epitélios confluentes de queratinócitos autólogos, cultivados segundo metodologia padronizada por Rheinwald e Green em 1975, têm sido usados como enxertos em diferentes situações clínicas. Contudo, a presença de componentes xenobióticos empregados nesta metodologia implica na possibilidade de transmissão de zoonoses, príons e viroses aos pacientes, além de envolver questões éticas relacionadas à utilização de animais. Tais preocupações têm direcionado pesquisadores a buscar alternativas que superem este impasse; no entanto, as formulações obtidas até o momento não são completamente satisfatórias. Assim, nossa proposta neste estudo, foi omitir ou substituir os componentes xenobióticos tradicionalmente utilizados no meio para queratinócitos, por similares humanos. Como resultado, padronizamos um meio de cultura onde omitimos o emprego de toxina colérica, substituímos o soro fetal bovino por lisado de plaquetas humanas na concentração de 2,5% e a insulina de origem bovina foi substituída por insulina recombinante humana na mesma concentração do método original (5 μg/mL). Com os resultados obtidos foi possível concluir ser viável o cultivo de queratinócitos humanos, mantidos em meio de cultura livre de componentes xenobióticos. / Confluent epithelia of autologous keratinocytes, cultivated according to standardized methodology by Rheinwald and Green in 1975, have been used as grafts in different clinical situations. However, the presence of xenobiotics components applied in this method implies the possibility of transmission of zoonoses, príons, and viruses to patients, besides involving ethical issues related to the use of animals for components obtainment. Such concerns have driven researchers to seek alternatives that overcome this deadlock, as the formulations obtained so far are not completely satisfactory. Thus, our proposal in this study was to omit or replace the xenobiotics components traditionally used in the medium to keratinocytes culture, by human similar. As a result, we have standardized a culture medium whereby we omitted the use of cholera toxin, replaced fetal bovine serum by human platelet lysate at a 2.5% concentration and bovine insulin was replaced by recombinant human insulin at the same concentration as the original method (5 μg/mL). With the results obtained we could conclude that the method to be viable to cultivate human keratinocytes, kept in culture medium free of xenobiotics components.

Freqüentemente as condutas terapêuticas utilizadas no tratamento de patologias bucais são cirúrgicas, resultando em falhas de continuidade da mucosa bucal. A possibilidade de obtenção de epitélios transplantáveis, a partir do cultivo in vitro de células da mucosa bucal, abre novas perspectivas de utilização, não se restringindo somente ao seu local de origem, ou seja, a boca, mas também como material de reconstrução para outras regiões, tais como: uretra, córnea, superfície ocular e epitélio córneo-limbal. Os métodos utilizados para a obtenção dessas células ainda são controversos na literatura. Neste sentido, avaliamos e comparamos a eficiência de dois métodos, enzimático e explante, para a obtenção de queratinócitos de mucosa bucal humana. Os fragmentos utilizados para a obtenção dessas células foram obtidos durante procedimentos cirúrgicos de pacientes voluntários saudáveis. Os queratinócitos foram cultivados sobre uma camada de sustentação, feeder-layer, confeccionada com fibroblastos murinos irradiados (3T3 - Swiss albino). Neste estudo foram comparados: o tempo para a obtenção dos queratinócitos, o rendimento obtido entre os dois métodos, a duração da vida útil em cultura, a capacidade que estas células tiveram em formar um epitélio in vitro e a morfologia dos mesmos. Os resultados obtidos, na avaliação dos dois métodos, comprovaram a possibilidade de obtenção dos queratinócitos, a partir de um pequeno fragmento bucal, porém pode-se verificar que existem vantagens e restrições peculiares a cada um dos métodos estudados. / The therapeutic procedures frequently used in oral treatments for the pathological diseases are surgical, resulting in failures of the mucosal continuity.The possibility to obtain transplantable oral epithelia from an in vitro cell culture opens new utilization perspectives not only to where it comes from, but also as a reconstructive matherial for other parts of the human body, such as: urethra, epithelia corneo-limbal, cornea, ocular surface. Many researchers still use controversial methods for obtaining cells. It was therefore evaluated and compared the efficiency in both methods: enzimatic and direct explant to obtain oral keratinocytes from human oral mucosa. Fragments of intra oral epithelial tissues from healthy human subjects, undergoing dental surgeries, were donated to the research project. The keratinocytes were cultivated over a feeder-layer from a previously irradiated 3T3 Swiss albino fibroblasts. In this study it was compared the time needed in the cell obtaintion, the best cell amount between both methods, the life-span, the cell capacity to form an in vitro epithelia and its morphologic structure. The results in the accessment of both methods have shown the possibility to obtain keratinocytes from a small oral fragment, but at the same time we may verify the advantages and peculiar restrictions for each one of both analyzed methods.

Neste trabalho foi estudada a formação de membranas para obtenção de compostos dermo-epidérmicos. A porção dérmica foi desenvolvida utilizando-se mistura de polímeros sintéticos, o poli(álcool vinílico) - PVAl ou poli(vinilpirrolidona) – PVP, com polímero natural, a quitosana. As membranas foram reticuladas pela radiação g ou glutaraldeído. A porção epidérmica destas membranas foi formada por queratinócitos cultivados in vitro, os quais foram semeados sobre as membranas correspondentes e verificada sua interação. As membranas que melhor interagiram com os queratinócitos foram aquelas preparadas com quitosana pela reticulação com glutaraldeído, porém não satisfazendo as características mecânicas de manipulação. As membranas que possuíam as melhores características mecânicas, porém com moderada interação com os queratinócitos, foram as compostas de PVAl, liofilizada e intumescida com quitosana. Os componentes foram caracterizados isoladamente, bem como as membranas formadas pelos mesmos. O PVAl foi caracterizado quanto a sua dose gel e a quitosana quanto à determinação das constantes de Mark-Houwink, grau de acetilação e dissolução em diferentes valores de pH. As membranas foram caracterizadas quanto a sua cinética de intumescimento com água. Na membrana de PVAl com quitosana incorporada foi avaliada sua degradação in vitro, determinada sua cinética de intumescimento com a quitosana e estimado o tamanho do poro. As membranas de quitosana reticuladas com glutaraldeído foram caracterizadas quanto à cinética de intumescimento e verificado o possível desprendimento de glutaraldeído. As duas membranas caracterizadas isoladamente foram unidas para formação de uma única membrana, como a parte dérmica do composto, onde a membrana de PVAl incorporada com quitosana foi recoberta com a membrana de quitosana reticulada com glutaraldeído. Quitosanas de outras procedências foram avaliadas na interação com os queratinócitos. / Membrane formations were studied to obtain dermal-epidermal compounds. The dermal portion was developed using synthetic polymers mixture, poly(vinyl alcohol)-PVAl or poly(vinylpyrrolidone)-PVP, with natural polymers, and chitosan. The membranes were crosslinked by gamma irradiation or glutaraldehyde. The epidermal portion of these membranes was formed by keratinocytes cultured in vitro, seeded on these membranes to verify their interaction. The membranes that interacted better with keratinocytes were those prepared with chitosan by glutraldehyde crosslinking, although not satisfying handling mechanical characteristics. The best mechanical characteristic was observed at PVAl membranes frezed dried and chitosan incorporated, but with moderate keratinocytes interaction. The components were characterized separately as well as the membranes formed by both. The PVAl was characterized as to its gel dose and to chitosan were determined Mark-Houwink equation, deacetilation degree and solubility under changes of pH. The membranes were characterized as to their swelling kinetic degree in water. In the membrane of PVAl with chitosan incorporated was evaluated its degradation in vitro, swelling kinetic degree with chitosan solution and the pore size. The chitosan membranes crosslinked by glutaraldehyde were characterized as to their swelling kinetic degree and verified the possibility of deatached glutaraldehyde. Membranes characterized separetelly were joined to perform the ideal dermal component, where the PVAl with chitosan incorporated membrane was covered by chitosan crosslinked by glutaraldehyde membrane. Chitosan from other sources were evaluated in the interaction with keratinocytes.

Neste trabalho foi estudada a formação de membranas para obtenção de compostos dermo-epidérmicos. A porção dérmica foi desenvolvida utilizando-se mistura de polímeros sintéticos, o poli(álcool vinílico) - PVAl ou poli(vinilpirrolidona) – PVP, com polímero natural, a quitosana. As membranas foram reticuladas pela radiação g ou glutaraldeído. A porção epidérmica destas membranas foi formada por queratinócitos cultivados in vitro, os quais foram semeados sobre as membranas correspondentes e verificada sua interação. As membranas que melhor interagiram com os queratinócitos foram aquelas preparadas com quitosana pela reticulação com glutaraldeído, porém não satisfazendo as características mecânicas de manipulação. As membranas que possuíam as melhores características mecânicas, porém com moderada interação com os queratinócitos, foram as compostas de PVAl, liofilizada e intumescida com quitosana. Os componentes foram caracterizados isoladamente, bem como as membranas formadas pelos mesmos. O PVAl foi caracterizado quanto a sua dose gel e a quitosana quanto à determinação das constantes de Mark-Houwink, grau de acetilação e dissolução em diferentes valores de pH. As membranas foram caracterizadas quanto a sua cinética de intumescimento com água. Na membrana de PVAl com quitosana incorporada foi avaliada sua degradação in vitro, determinada sua cinética de intumescimento com a quitosana e estimado o tamanho do poro. As membranas de quitosana reticuladas com glutaraldeído foram caracterizadas quanto à cinética de intumescimento e verificado o possível desprendimento de glutaraldeído. As duas membranas caracterizadas isoladamente foram unidas para formação de uma única membrana, como a parte dérmica do composto, onde a membrana de PVAl incorporada com quitosana foi recoberta com a membrana de quitosana reticulada com glutaraldeído. Quitosanas de outras procedências foram avaliadas na interação com os queratinócitos. / Membrane formations were studied to obtain dermal-epidermal compounds. The dermal portion was developed using synthetic polymers mixture, poly(vinyl alcohol)-PVAl or poly(vinylpyrrolidone)-PVP, with natural polymers, and chitosan. The membranes were crosslinked by gamma irradiation or glutaraldehyde. The epidermal portion of these membranes was formed by keratinocytes cultured in vitro, seeded on these membranes to verify their interaction. The membranes that interacted better with keratinocytes were those prepared with chitosan by glutraldehyde crosslinking, although not satisfying handling mechanical characteristics. The best mechanical characteristic was observed at PVAl membranes frezed dried and chitosan incorporated, but with moderate keratinocytes interaction. The components were characterized separately as well as the membranes formed by both. The PVAl was characterized as to its gel dose and to chitosan were determined Mark-Houwink equation, deacetilation degree and solubility under changes of pH. The membranes were characterized as to their swelling kinetic degree in water. In the membrane of PVAl with chitosan incorporated was evaluated its degradation in vitro, swelling kinetic degree with chitosan solution and the pore size. The chitosan membranes crosslinked by glutaraldehyde were characterized as to their swelling kinetic degree and verified the possibility of deatached glutaraldehyde. Membranes characterized separetelly were joined to perform the ideal dermal component, where the PVAl with chitosan incorporated membrane was covered by chitosan crosslinked by glutaraldehyde membrane. Chitosan from other sources were evaluated in the interaction with keratinocytes.

Orientador: Carlos Eduardo Vergani / Resumo: Nos últimos anos, os microcristais de prata têm se tornado foco de estudos. Uma das propriedades evidenciadas destes materiais é a sua atividade antimicrobiana contra diferentes microrganismos, devido a presença da prata na sua composição. Neste estudo, investigou-se a atividade antifúngica de microcristais de alfa vanadato de prata (α-AgVO3) contra Candida albicans (ATCC 90028) e sua citotoxicidade sobre células do tipo queratinócitos orais normais espontaneamente imortalizados (NOK-si). Os microcristias de α-AgVO3 foram sintetizados pelo método da co-precipitação sob três diferentes temperaturas (10, 20 e 30ºC) e caracterizados através de difração de raios-x, microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo e espectroscopia Raman. A atividade antifúngica foi avaliada a partir da microdiluição seriada dos microcristais (de acordo com o Clinical & Laboratorial Standards Institute - CLSI), onde foram determinadas as concentrações inibitória (CIM) e fungicida mínimas (CFM). Imagens de microscopia de fluorescência com os microcristais nas concentrações inibitória e fungicida mínimas foram obtidas a fim de confirmar os achados microbiológicos. A viabilidade celular de células NOK-si foi avaliada através do ensaio Alamar Blue, e imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de todos os grupos avaliados foram realizadas. Nos ensaios celulares foram utilizadas apenas quatro concentrações dos microcristais (CIM, CFM, CIM diluída 10 vezes e concentrada 10 vezes). Os r... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by João Arthur Martins (joao.arthur@ufpe.br) on 2015-04-08T19:25:32Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO UFPE - THIAGO GOMES DE FIGUEIREDO GONDIM GONDIM.pdf: 1777887 bytes, checksum: 04a3dbfbbbc52b848fcc8cb7fed2ab4f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T19:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO UFPE - THIAGO GOMES DE FIGUEIREDO GONDIM GONDIM.pdf: 1777887 bytes, checksum: 04a3dbfbbbc52b848fcc8cb7fed2ab4f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / CAPES E PROPESQ/UFPE / As células-tronco mesenquimais constituem uma rara população de células progenitoras com capacidade de diferenciação multipotencial e parecem constituir uma ferramenta atrativa no contexto da engenharia de tecidos e da terapia celular. O desenvolvimento de novos materiais pode ser citado como um setor de vanguarda para a engenharia de tecidos; e os biopolímeros despontam como biomateriais inovadores com vasta aplicação na biologia celular, especialmente em função de sua biocompatibilidade. Nesse contexto, temos como principal objetivo estudar a evolução das características morfológicas das células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano quando cultivadas sobre suportes de biopolímero de cana-de-açúcar (gel ou membranas), enfatizando-se a potencial capacidade dessas células diferenciarem-se em queratinócitos. Cordões umbilicais foram obtidos de parturientes do Setor de Obstetrícia do Hospital das Clínicas/UFPE (n=40, com 30 a 40 semanas de idade gestacional). Veias de cordões umbilicais foram preenchidas com colagenase tipo IV e mantidas a 37º C. As células coletadas foram centrifugadas por 10 minutos e ressuspendidas em meio DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, mistura de antibióticos e plaqueadas em garrafas (105 células/mL). Os aspectos morfológicos das células fenotipicamente semelhantes às células-tronco mesenquimais foram avaliados com 3, 5, 10, 14, 28, 40 e 45 dias, através de microscópio invertido com contraste de fase e sistema de captura de imagem. Com 72h de cultivo sobre um suporte comercial, observamos que as células-tronco mesenquimais apresentaram-se com aspecto fibroblastóide difuso e a formação de monocamada ocorreu com cinco dias. Células cultivadas em placas contendo o gel de biopolímero de cana-de-açúcar também apresentaram morfologia semelhante a fibroblastos (72h), porém mais alongadas e dispostas radialmente; com formação de monocamada em torno de sete dias. Quando cultivadas sobre membranas desse biomaterial, notamos com o auxílio de microscópio invertido, células com formato variando de arredondadas a fibroblastóides, e através da microscopia eletrônica de varredura foi possível detalhar essa variação no formato das células e perceber a emissão de finos prolongamentos (nanofibras). Nos ensaios de diferenciação das células-tronco mesenquimais em queratinócitos usando-se o gel de biopolímero de cana-de-açúcar como suporte, observamos que inicialmente grande parte das células conservou a morfologia arredondada e apresentaram-se de forma enfileirada, especialmente em algumas áreas do referido gel, e em torno de 14 dias a típica forma cubóide-arredondada das colônias de queratinócitos pode ser observada. Os resultados do nosso estudo sugerem que os suportes (gel ou membranas) de biopolímeros de cana-de-açúcar foram capazes de favorecer o crescimento e a diferenciação das células-tronco mesenquimais e mais experimentos deverão ser realizados para que o cultivo dessas células nessas condições, possivelmente, possa fornecer uma fonte eticamente não controversa e facilmente acessível de queratinócitos para futuras aplicações experimentais e clínicas.

RAS é a oncoproteína mutada mais encontrada em tumores sólidos, o que mostra seu grande potencial transformador. Não obstante, células que carregam essa mutação apresentam estresse oncogênico gerado por excessiva sinalização mitogênica, o que direciona preferencialmente as células portadoras para a morte em detrimento da transformação maligna. Basicamente a transformação direcionadapela proteína RAS mutada age sinergicamente com deficiência em supressores de tumor para evitar o destino celular preferencial frente ao estresse oncogênico. Este é o caso da interação observada entre HRASG12V e E6E7 de HPV, sendo que a infecção pelo vírus aparentemente é condição necessária em cânceres cervicais e muito presente em cânceres de cabeça e pescoço. A sinergia entre HRASG12V e queratinócitos imortalizados por E6E7 desequilibra o balanço homeostático entre subsistemas pró-morte, devido ao estresse oncogênico, ou pró-sobrevivência, que garante viabilidade por meio de novos padrões de robustez celular. Em ambos os casos, o processo que gera uma célula transformada, ou as elimina pelo caminho, apresenta pistas de vulnerabilidades às quais os queratinócitos são expostos uma vez que carreguem tal combinação de fatores. Apresentamos nesse trabalho os principais atores que compõem o estresse oncogênico deletério desencadeado pela atividade de HRASG12V: estresse mitogênico, replicativo e oxidativo; todos eles são responsáveis por provocar dano no DNA, que por sua vez promove parada no ciclo celular até que as células não possam mais suportar tamanha injúria, o que acaba levando-as maciçamente a morte. Mostramos que a alta intensidade mitogênica gerada pela atividade de HRASG12V provoca um desequilíbrio metabólico que leva ao aumento de espécies oxidantes e ao estresse replicativo. Todavia, um tratamento exógeno com o antioxidante NAC restaurou parcialmente a proliferação celular assim como a sobrevivência, agindo como um amenizador do dano no DNA gerado pelas espécies oxidantes. Já uma suplementação com nucleosídeos exógenos restaurou fortemente a sobrevivência celular, sugerindo que o desequilíbrio metabólico pode estar agindo no pool de nucleotídeos, o que poderia ser uma das causas do estresse replicativo. Como mecanismo intrínseco de sobrevivência, a autofagia se intensifica em resposta ao desequilíbrio sistêmico desencadeado pela atividade de HRASG12V. Por meio de sublinhagens defectivas para autofagia, mostramos que o processo retarda o aparecimento de espécies oxidantes, além de evitar sua elevação a níveis ainda mais drásticos, o que consequentemente ameniza o dano no DNA observado. Além disso, hipotetizamos que o processo poderia também estar contribuindo fortemente para a reciclagem de substratos básicos tais como nucleotídeos, assim acarretando em menor estresse replicativo. Na literatura atual, debate-se a noção de que, dependendo do contexto celular, a autofagia poderia promover tanto morte celular como transformação maligna. Entretanto, nesta tese mostramos que, na interação entre queratinócitos, E6E7 e HRASG12V, a autofagia é um mecanismo pró-sobrevivência: se por um lado a demanda autofágica é recrutada além de sua capacidade de processamento, fazendo com que seu fluxo seja bloqueado, por outro a eliminação do sistema se torna demasiadamente deletério, direcionando as células expostas ao estresse oncogênico causado pela atividade de HRASG12V necessariamente à morte. / Mutated RAS is the oncoprotein most found in solid tumors, which shows its huge tumorogenic potential. Despite of that, mutated RAS triggers a strong oncogenic stress, which very often drives cells to death instead of malignant transformation. Basically, the success of the Ras malignant transformation driving activity depends on a synergy between that mutated protein and inhibition of tumor suppression genes. This is the case of the interaction between HRASG12V and E6E7 proteins of HPV: It seems that HPV infection is an initial necessary condition for cervical cancer development and is also very frequent in head and neck carcinomas. The synergy between HRASG12V and E6E7, in pre-malignant keratinocytes, imbalances the homeostasis between pro-death subsystems, due oncogenic stress, and pro-survival subsystems that ensure new patterns of cellular robustness. In both cases, the process responsible for generating a malignant transformed cell or, more frequently, eliminating those cells carrying the combined characteristics, exposes the keratinocytes vulnerabilities. We showed in this work that the main actors of deleterious oncogenic stress triggered by HRASG12V activity are: Mitogenic, replicative and oxidative stresses; all of them induce DNA damage, hence cell cycle arrests until the cell cannot resist such injury any further, which leads to massive cell death. The intense mitogenic activity triggered by HRASG12Vcauses metabolic imbalance, which is responsible for an increase of oxidative species and replicative stress levels; the exogenous treatment with antioxidant NAC partially restored cell growth and cell survival, acting as a softener of the DNA damage caused by oxidative species. On the other hand, nucleoside supplementation strongly restored cell survival, suggesting that the aforementioned metabolic imbalance might be acting in the pool of nucleotides, hence it might be a possible cause of replicative stress. As an intrinsic survival mechanism, the autophagy is intensified in response to systemic imbalance triggered by HRASG12V activity. Through the autophagy defective subline, we showed that that mechanism both delays the increase of oxidative species and avoids their elevation to catastrophic highlevels. Furthermore, autophagy could strongly contribute to the recycling of basic substrates such as nucleotides, which might be mitigating the replicative stress. Nowadays, there is a debate on the role of autophagy promoting either malignant transformation or cell death depending on metabolic context. In this work, we showed an instance of the interaction between E6E7 and HRASG12V triggering autophagy pro-survival mechanisms and hence increasing general cell viability