CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cryptococcus neoformans species Complex comprises the main agents of cryptococcosis, an important systemic mycosis of nature and opportunistic. These species are capable of expressing multiple virulence factors that contribute to the development of resistance to antifungal therapeutic use. Research seeking new effective therapy measures are necessary. Heat shock proteins (Hsp) have been shown to be a promising molecular target for medical treatment of various diseases such as various forms of cancer and atherosclerosis. Studies have demonstrated that the expression of these chaperonins is also required for the maintenance of cellular homeostasis in different fungal pathogens. From this perspective, this study aimed to investigate the effect of blocking the protein Hsp90 front of sensitivity to antifungal agents in vitro planktonic cells and sessile, production of virulence factors in vitro and in vivo virulence in Cryptococcus neoformans species Complex. Therefore, the action of yeast Hsp90 protein was blocked with radicicol drug - an antibiotic capable of inhibiting the ATPase activity of Hsp90 - and then the cultures were evaluated for in vitro susceptibility to antifungal agents for therapeutic use in planktonic cells and associated in biofilms. We also assessed the effect of inactivation of Hsp90 on the production of virulence factors capsule, melanin and proteases. In addition, the in vivo virulence was investigated in a model of experimental infection using the nematode Caenorhabditis elegans. The results revealed that radicicol inhibited the growth of planktonic cells Cryptococcus spp. (n=12) with values of minimum inhibitory concentration (MIC) ranging from 0.5 to 2 μg/mL. We observed synergy between pharmacological and radicicol azoles. Furthermore, blockade of Hsp90 potentiated the effect of in vitro antifungal agents, particularly for the fluconazole and itraconazole, which MIC values were reduced by up to 64 times the face of isolated cells (n=12). Although the blockade of Hsp90 by isolated radicicol was not able to inhibit biofilm formation and biofilm formed of Cryptococcus spp. (n=12) (p>0.05), the inactivation of Hsp90 potentiated the effect of amphotericin B, azoles, especially fluconazole, when tested in combination with radicicol (p<0.05). Moreover, blockade of Hsp90 significantly reduced the volume of capsular Cryptococcus spp. (n=4) (p<0.05). However, no difference was observed in production of melanin by radicicol treated cells (n=4) (p>0.05) as well as the production of protease by strains of Cryptococcus spp. (n=4) (p>0.05). By contrast, inactivation of Hsp90 decreased virulence Cryptococcus spp. in vitro and in vivo in C. elegans (p<0.0001) as well as maximize the effect of fluconazole in vitro and in vivo. Therefore, Hsp90 is an important target for the development of antifungal strategies. However, further studies are needed to better understand the role of Hsp90 in fungal pathogens of the genus Cryptococcus spp. / O Complexo Cryptococcus neoformans/C. gattii compreende os principais agentes da criptococose, uma importante micose de natureza sistÃmica e carÃter oportunista. Essas espÃcies sÃo capazes de expressar mÃltiplos fatores de virulÃncia que contribuem para o surgimento de resistÃncia aos antifÃngicos de uso terapÃutico. Pesquisas que buscam novas medidas eficazes de terapia sÃo necessÃrias. ProteÃnas do choque tÃrmico (Hsp) tÃm se demonstrado um alvo molecular promissor em Ãrea mÃdica para o tratamento de diversas doenÃas, tais como diferentes tipos de cÃncer e aterosclerose. Estudos demonstram que a expressÃo dessas chaperoninas tambÃm à necessÃria para a manutenÃÃo da homeostase celular em diferentes patÃgenos fÃngicos. Nessa perspectiva, o presente estudo teve como objetivo investigar o efeito do bloqueio das proteÃnas Hsp90 frente à sensibilidade a antifÃngicos in vitro em cÃlulas planctÃnicas e sÃsseis, produÃÃo de fatores de virulÃncia in vitro e virulÃncia in vivo no Complexo Cryptococcus neoformans/C. gattii. Para tanto, a aÃÃo das proteÃnas Hsp90 fÃngicas foi bloqueada com o fÃrmaco radicicol â um antibiÃtico capaz de inibir a atividade ATPÃsica das Hsp90 â e, em seguida, as culturas foram avaliadas quanto à sensibilidade in vitro a antifÃngicos de uso terapÃutico em cÃlulas planctÃnicas e associadas em biofilmes. TambÃm foi avaliado o efeito da inativaÃÃo das Hsp90 sobre a produÃÃo dos fatores de virulÃncia cÃpsula, melanina e proteases. AlÃm disso, a virulÃncia in vivo foi investigada em modelo de infecÃÃo experimental utilizando o nematÃdeo Caenorhabditis elegans. Os resultados revelaram que o radicicol inibiu o crescimento das cÃlulas planctÃnicas de Cryptococcus spp. (n=12), com valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) que variaram de 0,5 â 2 μg/mL. Observou-se sinergismo farmacolÃgico entre o radicicol e os azÃlicos. Ademais, o bloqueio das Hsp90 potencializou o efeito dos antifÃngicos in vitro, sobretudo para o fluconazol e o itraconazol, os quais tiveram os valores de CIM reduzidos em atà 64 vezes frente Ãs cÃlulas isoladas (n=12). Embora o bloqueio das Hsp90 pelo radicicol isolado nÃo tenha sido capaz de inibir a formaÃÃo de biofilme e biofilme formado de Cryptococcus spp. (n=12) (p>0,05), a inativaÃÃo das Hsp90 potencializou o efeito da anfotericina B e derivados azÃlicos, sobretudo o fluconazol, quando testados em combinaÃÃo com o radicicol (p<0,05). AlÃm disso, o bloqueio das Hsp90 reduziu significativamente o volume capsular de Cryptococcus spp. (n=4) (p<0,05). PorÃm, nÃo observou-se diferenÃa na produÃÃo de melanina por cÃlulas tratadas com o radicicol (n=4) (p>0,05) assim como na produÃÃo de proteases pelas cepas de Cryptococcus spp. (n=4) (p>0,05). Em contrapartida, a inativaÃÃo das Hsp90 diminuiu a virulÃncia de Cryptococcus spp. in vitro e in vivo em C. elegans (p<0,0001) alÃm de potencializar o efeito do fluconazol in vitro e in vivo. Portanto, as Hsp90 sÃo um importante alvo para o desenvolvimento de estratÃgias antifÃngicas. Todavia, estudos mais aprofundados sÃo necessÃrios para melhor compreender o papel das Hsp90 nos patÃgenos fÃngicos do gÃnero Cryptococcus spp.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:10036 |
| Date | 29 January 2015 |
| Creators | Antonio Josà de Jesus Evangelista |
| Contributors | Rossana de Aguiar Cordeiro, Marcos FÃbio Gadelha Rocha, Reginaldo GolÃalves de Lima Neto |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em CiÃncias MÃdicas, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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