Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T00:02:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1
277525.pdf: 903897 bytes, checksum: 7d856e166a29a1927236c8c628ced144 (MD5) / As lipases e esterases pertencem ao grupo das hidrolases e são enzimas capazes de catalisar a clivagem e formação de ligações ésteres. Essas enzimas são empregadas em diferentes ramos industriais, principalmente na indústria química, farmacêutica e de alimentos. A lipase (AF208229) de Staphylococcus xylosus foi previamente isolada, clonada, seqüenciada e caracterizada. O objetivo deste trabalho foi avaliar a importância do resíduo de aminoácido valina 309 para atividade enzimática desta lipase, modificando a valina 309 por aspartato ou lisina através da PCR mutagênese sitio dirigida. A mutação foi realizada com sucesso e os mutantes (Mut-Asp e Mut-Lys) apresentaram características diferentes da lipase recombinante selvagem (WT-Val) em relação a hidrólise do butirato de p-nitrofenila. Foi observado que a substituição do aminoácido 309 aumentou a atividade das lipases mutantes, principalmente com a presença do aminoácido básico (Mut-Lys). No entanto, a afinidade da enzima ao substrato diminui após a substituição do aminoácido valina, ocasionando aumento em duas vezes do valor de Km para as enzimas mutantes. A atividade ótima para as três lipases recombinantes foi observada em pH 9,0 e a 42°C, sendo que, a Mut-Lys apresentou a maior atividade no pH alcalino. A lipase recombinante selvagem (WT-Val) e as lipases mutantes Mut-Asp e Mut-Lys mostraram ser termoestáveis após incubação a 80°C, visto que não foi observada perda na atividade nos períodos de incubação analisados (10, 20 e 30 min), fato observado pela primeira vez para lipases do gênero Staphylococcus. A imobilização de enzimas é uma estratégia bastante utilizada para modificar a atividade enzimática e propiciar o uso de biocatalisadores nos processos industriais. A esterase de Lactobacillus plantarum foi previamente isolada, clonada, seqüenciada e caracterizada. Neste trabalho, esta esterase foi expressa em E. coli e o lisado celular foi imobilizado no suporte hidrofóbico polipropileno (Accurel MP1000) pelo método de adsorção e apresentou eficiência de 68,7%. A enzima imobilizada mostrou ser mais estável nas diferentes temperaturas testadas, como também, apontou ser mais termoestável que o lisado celular de enzima livre, mostrando que o processo de imobilização ocasiona restrição na mobilidade conformacional e maior rigidez na estrutura da enzima, impedindo a desnaturação e a perda da capacidade catalítica. A enzima imobilizada apresentou menor atividade específica e menor afinidade pelo substrato em relação a enzima livre, frente a hidrólise do butirato de p-nitrofenila. Não foi observado desprendimento de proteína do suporte após 3 ciclos contínuos e a atividade de hidrolise da enzima imobilizada foi estável até a terceira semana após ser imobilizada. / The lipases and esterases belong to the group of hydrolases and these enzymes are capable of catalyzing the cleavage and formation of ester bonds. These enzymes are used in different industrial fields, mainly in the chemical, pharmaceutical and food industries. Lipase (AF208229) of Staphylococcus xylosus was previously isolated, cloned, sequenced and characterized. The objective of this study was to evaluate the importance of the amino acid valine 309 for activity of lipase, changing valine 309 to aspartate or lysine by PCR site directed mutagenesis. The mutation was successfully performed and the mutant (Mut and Mut-Asp-Lys) had different characteristics from recombinant lipase wild (WT-Val) for the hydrolysis of butyrate p-nitrophenyl. It was observed that the substitution of amino acid 309 increased the activity of lipase mutants, especially with the presence of basic amino acid (Mut-Lys). However, the affinity of the enzyme to the substrate decreases after substitution of the amino acid valine, leading to increased at twice the value of Km for mutant enzymes. The optimum activities for the three recombinant lipases were observed at pH 9.0 and 42° C, and the Mut-Lys showed the highest activity at alkaline pH. Recombinant lipase wild-type (WT-Val) and the mutants Mut-Asp and Mut-Lys proved to be heat-stable after incubation at 80°C, whereas there was no loss of activity in the incubation periods examined (10, 20 and 30 min ). This result was first observed for lipases of Staphylococcus. The immobilization of enzymes is a strategy often used to modify the enzymatic activity and promote the use of biocatalysts in industrial processes. The esterase of Lactobacillus plantarum was previously isolated, cloned, sequenced and characterized. In this work, this esterase was expressed in E. coli and the cell lysate was immobilized on the support hydrophobic polypropylene (Accurel MP1000) by the method of adsorption and presented efficiency of 68.7%. The immobilized enzyme was more stable at different temperatures, and also was more thermostable than the cell lysate of free enzyme, showing that the immobilization process can causes restricted mobility and greater rigidity in the structure of the enzyme, preventing the denaturation and loss of catalytic ability. The immobilized enzyme showed a lower specific activity and a lower affinity by the substrate than the free enzyme for hydrolysis of butyrate p-nitrophenyl. It was not observed detachment of protein support after 3 continuous cycles and the hydrolysis activity of immobilized enzyme was stable until the third week after being immobilized.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/93545 |
| Date | 25 October 2012 |
| Creators | Kolling, Deise Juliana |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Arisi, Ana Carolina Maisonnave |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 76 p.| grafs, tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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