Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de
disfunción visual en el mundo desarrollado. En ellas se produce la degeneración y
muerte de las neuronas fotorreceptoras, originando una disminución o pérdida total de la
visión, en los casos más severos. Las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo
de células gliales en la retina, y las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR)
desempeñan un papel clave tanto en la prevención como en el progreso de estas
enfermedades. En condiciones fisiológicas las CGM y las células del EPR son las
encargadas del mantenimiento estructural, fisiológico y funcional de la retina. Ante
alteraciones fisiológicas o frente a daños de diferentes tipos, las CGM y las células del
EPR modifican levemente sus funciones a fin de restablecer las condiciones normales o
reparar los daños existentes. La proliferación y la migración se activan como parte de
una respuesta inespecífica, pero cuando el daño persiste por mecanismos aún
desconocidos estos procesos se descontrolan y exacerban, tornándose
contraproducentes. A su vez, la localización de estas células en lugares inadecuados
distorsiona severamente la estructura y función de la retina, contribuyendo al desarrollo
de la disfunción visual, particularmente en las patologías retinoproliferativas. Dilucidar
los mecanismos de regulación de la proliferación y la migración, como así también las
moléculas que intervienen, es clave para lograr un tratamiento integral de estas
enfermedades.
Los esfingolípidos bioactivos son moléculas señal que regulan una gran
cantidad de procesos biológicos como la supervivencia, proliferación, migración e
inflamación. Entre éstos, la ceramida-1-fosfato (C1P) es un esfingolípido que regula
numerosas funciones biológicas en diferentes tipos de células. La C1P es generada por
la acción de la ceramida quinasa (CerK), enzima encargada de sintetizar C1P a través de
la fosforilación de la ceramida (Cer). La actividad de CerK es clave para la señalización
celular mediada por C1P y está regulada por niveles bajos de Ca+2, fosforilación y
diversos estímulos. La C1P promueve la proliferación través de la activación de
diferentes vías de señalización intracelular y la inflamación mediante la unión y
activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), que interviene en la síntesis de
prostaglandinas. Para promover la migración, se ha propuesto que la C1P activa un
receptor extracelular específico (parcialmente identificado). Trabajos previos de nuestro
laboratorio demuestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo
muy relacionado a la C1P, promueve la migración de las CGM (Simón et al. 2015).
Dada la estrecha interacción metabólica y funcional entre los esfingolípidos, es de gran
interés establecer si la C1P, cuyas funciones son semejantes a las de S1P, interviene en
la regulación de los procesos que contribuyen a las patologías retinoproliferativas.
El objetivo de esta Tesis es investigar si la C1P y la CerK participan en la
migración y en la proliferación de las CGM y las células del EPR.
Mediante el ensayo de la herida y utilizando cultivos gliales puros de retina de
rata y la línea celular humana de EPR, ARPE-19 investigamos los posibles efectos de
C1P/CerK en la migración de estos dos tipos celulares. En estos ensayos de motilidad
celular, consideramos la reducción del ancho de la herida como un indicador de la
migración.
Al evaluar el efecto de C1P sobre la migración de las CGM, determinamos
que la C1P aumentó la migración a través de la reorganización del citoesqueleto de
actina y la formación de filopodios y lamelipodios. Mediante ensayos de incorporación
del nucleótido Bromo-deoxiuridina (BrdU) establecimos que la migración no
contribuyó al cierre de la herida. Luego investigamos las vías de señalización
involucradas en el efecto de C1P. La inhibición de las vías PI3K/Akt y JNK con
LY294002 y SP600125, respectivamente, disminuyó la migración glial, tanto en los
controles como en los cultivos tratados con C1P. Mediante ensayos de Western blot
comprobamos que el agregado de C1P aumentó los niveles de p-Akt, forma activa de la
Akt, respecto a los controles, confirmando la activación de la vía de la PI3K. Al inhibir
la vía de ERK / MAPK con el inhibidor U0126 disminuyó la migración promovida por
la C1P, pero no se alteró la migración en los controles. A continuación, evaluamos el
papel de la cPLA2, mediador de C1P en la inflamación, que es activada por su unión a
C1P. El tratamiento con ATK, un inhibidor de cPLA2, redujo notablemente la migración
glial en cultivos tratados con C1P, mientras que en los cultivos controles la migración
no fue alterada. Demostramos así que la C1P promueve la migración de las CGM
mediante la activación de cPLA2 y JNK, PI3K y ERK / MAPK. Además, el agregado
conjunto de C1P y S1P, evidenció que estos esfingolípidos tuvieron juntos el mismo
efecto promotor de la migración glial que cuando fueron suplementados por separado,
evidenciando una interrelación entre ellos en la regulación de los mecanismos que
activan río abajo.
Como la realización de la herida activó la migración celular, decidimos
evaluar si la síntesis endógena de C1P estaba involucrada en dicha migración. Para ello,
establecimos en primer término, mediante RT-PCR que las CGM expresaban CerK.
Incubando los cultivos gliales con NVP231, un inhibidor de la CerK, demostramos que
la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración glial en los controles y para
la estimulación de la migración por C1P. Para descartar que la inhibición de la
motilidad reflejara una pérdida de viabilidad celular, evaluamos dicha viabilidad por
ensayo de MTT. Determinamos que el tratamiento de los cultivos gliales con NVP231
no alteró la viabilidad celular.
En las células del EPR el tratamiento con C1P aumentó la migración,
mediante la reorganización del citoesqueleto de actina y el desarrollo de extensos
lamelipodios. Al evaluar el rol de la síntesis endógena en la migración del EPR,
comprobamos que el tratamiento de los cultivos con NVP231 inhibió la formación de
lamelipodios y bloqueó la migración de las células epiteliales. Determinamos, mediante
el ensayo de MTT, que el tratamiento con NVP231 no alteró la viabilidad de las células
del EPR. La C1P y la S1P promovieron la migración de las células del EPR, pero
cuando los cultivos fueron tratados con NVP231 antes del agregado de estos
esfingolípidos, el aumento de la migración que promovían fue bloqueado. Estos
resultados demuestran que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración
promovida por C1P y S1P, evidenciando que la síntesis de C1P es clave en la
estimulación de la migración por estos dos esfingolípidos.
A continuación evaluamos el rol de C1P en la proliferación. Ensayos de incorporación
del nucleótido BrdU en cultivos no confluentes demostraron que el agregado de C1P no
alteró la proliferación ni en los cultivos gliales ni en los epiteliales. La inhibición de la
síntesis de C1P redujo la proliferación en las CGM, mientras que no alteró la tasa de
proliferación de los cultivos epiteliales, lo que sugiere que la C1P sería un mediador
necesario para la proliferación glial en el período activo de mitogénesis de estas células.
En conclusión, en este trabajo evidenciamos por primera vez que la C1P agregada
exógenamente como así también aquella sintetizada por CerK en el interior celular,
potenciaron la migración de las CGM y de las células del EPR. Demostramos también
que la síntesis de C1P fue necesaria para la proliferación glial. Considerando la
importancia del proceso de migración y proliferación en los dos tipos celulares de la
retina decisivos en la mayoría de las enfermedades retinianas, proponemos a C1P/CerK
como clave en el desarrollo y avance de las retinopatías proliferativas. / Retinal neurodegenerative diseases are the main cause of visual dysfunction in
the developed world. Their common feature is the degeneration and eventual death of
photoreceptors, which leads to visual impairment and eventual blindness in the most
severe cases. Müller Glial Cells (MGC) are the main type of retinal glia and along with
the Retinal Pigmented Epithelium (RPE) these cell types are two key factors in both the
prevention and progression of these diseases. Under physiological conditions, MGCs
and the RPE are in charge of the structural, physiological and functional maintenance of
the retina. When faced with physiological changes or different damages, they alter their
regular functions in order to either reestablish a proper environment or repair the
existing damages; however, if the damage persists, the long-term changes of their
aforementioned functions can be counterproductive and contribute to the development
of retinal neurodegenerative pathologies.
Proliferation and migration are activated as an unspecific response upon
different damages in order to repair them but, due to unknown mechanisms, these
processes finally provoke retina structural and functional loss, thus contributing to the
progression of the visual dysfunction. The elucidation of the regulatory mechanisms
involved in controlling migration and proliferation, including the molecules involved, is
crucial for developing an integral treatment of these diseases.
Bioactive sphingolipids are signaling molecules that regulate a wide array of
biological processes, such as survival, proliferation, migration and inflammation.
Among them, ceramide-1-phospate (C1P) is a sphingolipid generated by ceramide
kinase (CerK), the enzyme responsible of phosphorylating ceramide (Cer) molecules.
CerK activity has a central role in C1P-mediated cellular signaling, and is regulated by
low levels of Ca2+, phosphorylation and many other stimuli. C1P promotes proliferation
by activating several intracellular signaling pathways, as well as promoting
inflammation by coupling with and activating the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2),
which participates in prostaglandin synthesis. Both for proliferation and migration, it
has been proposed that C1P activates a (partially identified) specific extracellular
receptor. Previous work from our group has shown that sphingosine-1-phospate (S1P),
which is metabolically closely related to C1P, promotes MGC migration (Simón et al.
2015). Due to the close interconversions and functions of sphingolipids, uncovering the
role of C1P in the processes involved in proliferative retinopathies is highly relevant.
The purpose of this thesis is to investigate whether C1P and CerK participate in
the regulation of migration and proliferation of MGC and RPE.
By using the scratch wound assay in pure rat glial cultures and the RPE cell line
ARPE-19, we assessed the effects of C1P/CerK in the migration of these two cell types.
In these cellular motility assays we considered the reduction on the wound width as a
positive indicator of cell migration.
When evaluating the effect of C1P on migration, we determined that C1P
enhanced migration by reorganizing the actin cytoskeleton and the formation of
filopodia and lamellipodia. By quantifying the uptake of Bromide-deoxyuridine (BrdU)
by MGC we determined that proliferation did not contribute to the reduction in the
scratch width. We also investigated the signaling pathways involved in this process.
Inhibition of PI3K/Akt and JNK pathways with the selective inhibitors LY294002 and
SP600125, respectively, showed a decrease in glial migration in both control and C1Ptreated
cultures. Western Blot assays showed that the addition of C1P increased the
levels of p-Akt (the active form of Akt) when compared to controls, therefore
confirming the activation of this pathway. Selective inhibition of the ERK/MAPK
pathway with U0126 showed a decrease in C1P-induced migration, but did not alter it in
control conditions. We also evaluated the role of cPLA2, a mediator of C1P in
inflammation, which is activated by C1P binding. Treatment with ATK, a selective
inhibitor of cPLA2, showed a substantial decrease in migration on C1P-treated cultures,
while there was no alteration of the migrating capabilities in control conditions.
We therefore showed that C1P is a promotor of MGC migration by activating cPLA2 as
well as the JNK, PI3K and ERK/MAPK pathways. In addition, the combined addition
of C1P and S1P showed that these sphingolipids had the same effect together than when
they were added separately, suggesting either a direct relation between them or with the
downstream mechanisms they trigger.
Since we determined a basal reduction in the scratch width in control conditions,
we evaluated whether the endogenous synthesis of C1P was involved in this migration.
Initially, we established by RT-PCR assays that CGM expressed CerK. By incubating
glial cultures with NVP231, a selective inhibitor of CerK, we showed that endogenous
C1P synthesis was necessary for glial migration under control conditions, and that when
this synthesis was inhibited addition of C1P did not restore cell migration. In order to
verify that NVP231 did not affect cell viability, we evaluated viability by the MTT
assay. We determined that treatment of glial cultures with NVP231 did not alter cell
viability.
On RPE cells, treatment with C1P increased cell migration by inducing actin
cytoskeleton reorganization and extensive development of lamellipodia. When
evaluating the role of the endogenous synthesis on RPE migration, we concluded that
treating cultures with NVP231 inhibited lamellipodia formation and blocked RPE
migration. We also determined that the viability of NVP231-treated RPE cells was not
altered. Both C1P and S1P promoted RPE cell migration, but treating the cultures with
NVP231 beforehand, abolished the migratory stimulus. These results show that
endogenous C1P synthesis is essential for C1P and S1P-promoted migration,
establishing that C1P synthesis is crucial to promote the migration of these two
sphingolipids.
Furthermore, we evaluated the possible role of C1P on cell proliferation. BrdU
uptake assays on non-confluent cultures showed that the addition of C1P did not alter
the proliferating capabilities on either MGC or RPE cultures. The inhibition of C1P
synthesis impaired proliferation of MGCs, but did not affect that of RPE cells,
suggesting that C1P might be a necessary mediator for glial proliferation in the active
mitogenic stage of these cells.
In this work we showed for the first time that both addition of C1P as well as the
endogenous C1P produced by CerK promote migration of MGC and RPE cells. We also
demonstrated that C1P synthesis is required for glial proliferation. Taking into
consideration the relevance of migration and proliferation of both cell types in the
development of most retinal diseases, we propose that C1P/CerK is instrumental in the
development and progression of proliferative retinopathies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/4654 |
| Date | 14 March 2019 |
| Creators | Vera, Marcela Sonia |
| Contributors | Rotstein, Nora Patricia, Politi, Luis E. |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 2 |
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