A causa mais comum da osteoporose é o declínio do hormônio sexual feminino, o estrógeno, que ocorre após a menopausa. Esse hormônio regula a produção de citocinas que influenciam a proliferação dos osteoclastos, aumentando a reabsorção óssea. Os efeitos da cafeína no metabolismo ósseo são controversos e podem estar associados ao aumento significativo de doenças periodontais, fraturas, aumento do cálcio urinário e redução da densidade mineral óssea, por exercer efeitos inibidores sobre as funções dos osteoblastos. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o efeito in vitro de diferentes concentrações de cafeína no metabolismo de células osteoblásticas da medula óssea de ratas osteoporóticas. Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais, ratas Wistar foram divididas em dois grupos experimentais: controle (C) e submetidas à ovariectomia (OVX). Após 60 dias da cirurgia, as ratas foram sacrificadas para coleta dos fêmures e das células mesenquimais da medula óssea, que foram induzidas à diferenciação em osteoblastos com meio osteogênico com três concentrações de cafeína (1, 3 e 5 mM - grupos OVX1, OVX3 e OVX5) e cultivadas em placas de 24 poços (n = 5) para avaliação da proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) bioquímica e in situ, detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão de genes relacionados à atividade osteoblástica através de PCR em tempo real. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por meio do software estatístico GraphPad Prism, com nível de significância fixado em 5%. A proliferação celular foi menor nos grupos osteoporóticos com adição de cafeína, tendo a menor queda o grupo com adição de 1mM. O método bioquímico de ALP não foi significante nos períodos analisados, entretanto, aos 10 e 14 dias, a atividade aumentou quando a concentração de cafeína era maior. Já na atividade de ALP in situ, o grupo OVX1 foi o que apresentou melhor resultado nos períodos avaliados (p < 0,05), com pico aos 14 dias. A quantificação de matriz mineralizada foi maior no grupo OVX comparado ao grupo C; entre as concentrações, a maior quantificação dos nódulos de cálcio se deu no grupo com 1mM de cafeína. Os resultados obtidos no PCR mostraram que o gene para fosfatase alcalina teve maior expressão no grupo OVX, seguido do grupo OVX1 aos 7 e 10 dias; a expressão gênica de osteocalcina foi maior para o grupo OVX1 aos 10 e 14 dias e esse grupo apresentou a maior expressão em todos os períodos para os genes Runx2 e RankL. No caso do Bmp4, o grupo OVX3 foi o mais expresso aos 10 e 14 dias. Os genes osteoprotegerina e osteopontina variaram sua expressão de acordo com o período e grupo avaliado. A expressão de osterix foi similar entre os grupos aos 7 e 10 dias, enquanto a expressão de Bsp, aos 7 e 14 dias, mostrou semelhança entre os grupos controle e OVX1. Frente aos resultados obtidos, sugere-se que a concentração de 1mM de cafeína pareceu ser a menos prejudicial ao metabolismo das células osteoblásticas neste modelo experimental de osteoporose. / The most common cause of osteoporosis is the decrease of estrogen after menopause. This hormone regulates the production of cytokines that influence osteoclast proliferation, increasing bone resorption. The effects of caffeine in bone metabolism are controversial and may be associated to periodontal disease, bone fractures, increase of urinary calcium levels and reduction of mineral bone density due to inhibition of osteoblast activities. Thus, the goal of this investigation was to evaluate the in vitro effect of different caffeine concentrations in the metabolism of bone marrow osteoblastic cells from osteoporotic rats (OVX). After Ethical Committee approval, wistar female rats were divided in two experimental groups: control (C) and submitted to ovariectomy (OVX). After 60 days of surgery, femurs were removed to isolate bone marrow mesenchymal cells, which were induced to osteoblastic differentiation in osteogenic medium along with three different concentrations of caffeine (1, 3 and 5 mM - OVX1, OVX3 e OVX5 respectively) and posteriorly seeded in 24-well plates (n = 5) to evaluate cell proliferation, alkaline phosphatase activity and its in situ detection, detection and quantification of mineralized nodules as well as assess quantitative expression of genes associated to osteoblastic activity by means of real time PCR. All the experiments were performed in triplicate and analyzed by means of the statistical software GraphPad Prism for p<0.05. Cell proliferation was diminished in the all osteoporotic groups that received caffeine, with group OVX1 being the less affected. Biochemical assay of ALP activity did not show differences among the groups in the periods analyzed; nevertheless there was a tendency to a higher activity proportional to the higher concentration of caffeine. The in situ detection of ALP showed better results in group OVX1 after 14 days of culture. Mineralized matrix quantification was higher in OVX groups when compared to control group; among the concentrations, the higher quantification of calcium nodules was in group OVX1. The results obtained with PCR showed that the gene for ALP had its highest expression in OVX group, followed by OVX1 at 7 and 10 days; expression of osteocalcin was higher in OVX1 after 10 and 14 days and this same group presented higher expression in all periods for genes Runx2 e Rankl. Analysis of Bmp4 gene showed that it was expressed in group OVX3 after 10 and 14 days. The genes that code for osteoprotegerin and osteopontin had different expression values in accordance to the period and group evaluated. The expression of osterix was similar between the groups after 7 and 10 days, whereas the expression of Bsp was similar between control and OVX1 groups after 7 and 14 days. The results suggest that the concentration of 1mM of caffeine is the most beneficial to the metabolism of osteoblastic cells in a model of osteoporosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-01032018-170452 |
| Date | 24 February 2017 |
| Creators | Roger Rodrigo Fernandes |
| Contributors | Karina Fittipaldi Bombonato Prado, Larissa Moreira Spinola de Castro Raucci, Selma Siessere, Lucas Novaes Teixeira |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Biologia Oral, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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