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Previous issue date: 2016-12-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Recent researches have emphasized the importance of redox mechanisms for platelet function modulation. The platelet surface contains a large variety of integrin receptors and other molecules presenting functional thiol groups in their structures, which are potential targets for redox regulation. Among these various thiol-containing proteins, integrin αIIbβ3 stands out for being the convergence path of platelet activation induced by various agonists. Activation of αIIbβ3 integrin is catalyzed by protein disulfide isomerase (PDI) through an essential conformational change leading to the exposure of fibrinogen-binding site. Thus, PDI has been shown to be an important target for the development of antiplatelet drugs. In recent years, many studies have described substances from plan (DE A. PAES et al., 2011), as well as synthetics that are capable of inhibiting PDI. In a previous study of our research group has shown that the synthetic peptide CxxC, which contains the redox motif of PDI in its original sequence CGHC, inhibited reductase activity of this enzyme, effect not observed with AxxA peptide, whose cysteines were replaced with alanine and Scr peptide, which contains the same aminoacids from CxxC peptide, but under random sequence. It has been also demonstrated that CxxC peptide was the only to reduce by 30% ADP-induced aggregation (5μM) in platelet rich plasma, an effect apparently mediated by the association of CxxC and PDI at platelet surface. Thus, in this work, we further assessed the effects of CxxC and its control peptides on platelet aggregation. Washed human platelets were incubated with CxxC peptide at concentrations of 3, 6 and 10 μM, resulting in a dose-dependent inhibition of maximum aggregation activated by thrombin (0.02 U/mL) at 25, 60 and 74%, respectively with IC50 of 6.13 ± 1.09 μM. The presence of control peptides did not produce any inhibitory effect. CxxC peptide also reduced the activation of αIIbβ3 integrin at platelet surface, but did not affect the expression of the markers CD 62-P and CD 63. Control peptides did not alter the expression of these markers. Analysis by mass spectrometry of the interaction of recombinant human PDI with the peptide showed that only CxxC peptide associated with the redox Cys400 of a’ motif of PDI, which has been considered essential for platelet aggregation. Together, these results demonstrate that CxxC peptide reduces platelet aggregation by association with PDI and can be further used as a model for the development of new antithrombotic drugs. / Investigações recentes têm enfatizado a importância de mecanismos redox na modulação da função plaquetária. A superfície da plaqueta contém grande variedade de integrinas e outras moléculas receptoras que possuem tióis funcionais em sua estrutura, os quais são alvos potenciais de regulação redox. Dentre estas várias proteínas tiólicas, a integrina αIIbβ3 destaca-se por ser a via de convergência da ativação plaquetária induzida por diversos agonistas. A ativação da integrina αIIbβ3 é catalisada pela proteína dissulfeto isomerase (PDI), essencial à mudança de conformação que leva à exposição do sitio de ligação ao fibrinogênio. Sendo assim, a PDI tem se mostrado como um alvo importante para o desenvolvimento de fármacos reguladores da agregação plaquetária. Nos últimos anos, diversos estudos têm descrito substâncias de origem vegetal, animal e sintéticas que são capazes de inibir a PDI. Em trabalho do nosso grupo de pesquisa (DE A. PAES et al., 2011), demonstrou que o peptídeo sintético CxxC, o qual contém o motivo redox da PDI na sua sequência original CGHC, inibiu a atividade redutase desta enzima; efeito não observado com os peptídeos AxxA, que possui as cisteínas substituídas por alanina e Scr, peptídeo controle contendo os mesmos aminoácidos do peptídeo CxxC, porém com sequência aleatória sem formação de ditiol. Demonstrou-se, também, que apenas o peptídeo CxxC reduziu em 30% a agregação induzida por ADP (5M) em plasma rico em plaquetas, efeito aparentemente mediado pela associação do CxxC com a PDI na superfície plaquetária. Sendo assim, neste trabalho continuamos a avaliação dos efeitos do peptídeo CxxC e seus controles sobre a agregação plaquetária. Para tanto, incubamos lavado de plaquetas humanas com o peptídeo CxxC nas concentrações de 3, 6 e 10 μM, resultando em inibição concentração-dependente da agregação ativada por trombina (0,02 U/mL) em 25, 60 e 74 %, respectivamente, com IC50 de 6,13 ± 1,09 μM. A presença dos peptídeos controle não produziu quaisquer efeitos inibitórios. O peptídeo CxxC reduziu a ativação da integrina αIIbβ3 na superfície da plaqueta, porém não impactou a expressão dos antígenos CD 62-P e CD 63. Os peptídeos controle não alteraram a expressão desses marcadores. A análise por espectrometria de massas da interação da PDI recombinante humana com os peptídeos, mostrou que apenas o peptídeo CxxC associa-se com a Cys400 do motivo redox a’ da hPDI, o qual tem sido considerado fundamental para a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados demonstram que o peptídeo CxxC reduz a agregação plaquetária via associação com a PDI, podendo ser empregado como modelo para o desenvolvimento de fármacos novos antitrombogênicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede/1632 |
| Date | 06 December 2016 |
| Creators | Sousa, Hiran Reis |
| Contributors | Santos, Ana Paula Silva de Azevedo dos, Paes, Antônio Marcus de Andrade |
| Publisher | Universidade Federal do Maranhão, PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE/CCBS, UFMA, Brasil, DEPARTAMENTO DE MEDICINA I/CCBS |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFMA, instname:Universidade Federal do Maranhão, instacron:UFMA |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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