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Previous issue date: 2009-09-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In somatic cell nuclear transfer (SCNT), the type of the recipient cytoplast plays a key role on
nuclear reprogramming. Distinct cytoplasts and karyoplasts and different activation
protocols were used for bovine embryo cloning aiming to evaluate the effect of the type of
cytoplast (oocyte and/or zygote) and the activation protocol (chemical, AQ, or spermatic, AE)
on development of cloned blastocysts produced by handmade cloning (HMC). After 17 h of in
vitro maturation (MIV), 2,946 oocytes were enucleated by manual bisection resulting in either
MII cytoplasts (enucleated) or MII karyoplasts (non-enucleated). An additional group of
2,368 oocytes, in vitro-fertilized (FIV) for 6 h, were manually bisected and segregated in
either FIV cytoplasts (enucleated) or FIV karyoplasts (non-enucleated). Cells from a primary
culture previously established from a skin biopsy from an adult female bovine were used as
nuclei donors (karyoplast CS). Structures were allocated to (a) control groups: FIV;
parthenogenesis using zona-intact (PG c/) or zona-free oocytes (PG s/); and clones by SCNT;
or (b) experimental groups: G1, FIV cytoplast + MII cytoplast + CS karyoplast; G2, MII
cytoplast + FIV karyoplast; G3, FIV cytoplast + FIV karyoplast; G4, FIV cytoplast + FIV
cytoplast + CS karyoplast; and G5, MII cytoplast + MII karyoplast. Following electrofusion,
experimental groups G1 to G5 were allocated to sub-groups of either sperm-mediated (AE) or
additional chemical (AQ) activation. The in vitro culture was carried out in the WOW (wellof-
the-well) system. After 20 replications, cleavage (D2) and blastocyst (D7) rates were
compared by the χ2 test, with values for total cell number and cell allocation in the blastocyst,
determined by differential staining, being evaluated by ANOVA, with pairwise comparisons
by the Tukey test, for P<0.05 (P<0.05). The only experimental group that yielded a blastocyst
development similar to the FIV (27.0%) and SCNT (31.4%) control groups was the subgroup
G1 AE (28.2%). This fact may be attributed to a more proper synchrony between the
karyoplast and cytoplasts and/or to a more suitable activation process. Embryo development
in subgroups G1 AQ (13.7%), G4 AQ (6.4%) and G4 AE (8.7%) was lower than in G1 AE,
possibly due to a higher degree of asynchrony in the activation process or cell cycle. The lack
of development in groups G2 and G3, irrespective of the activation protocol, was possibly due
to the manipulation process during a highly sensible biological period. Likewise, the low
cleavage (57.0%) and the lack of development in group G5 (spontaneous activation) in fact
showed that the manipulation induced weak spontaneous oocyte activation. In general, total
cell number and cell allocation were similar between groups with development to the
blastocyst stage. In conclusion, the activation process appeared to be as important to embryo
development as the type of cytoplast or karyoplast used for embryo reconstruction. The
production of cloned bovine embryos using a more physiological activation process (AE) was
proven as a viable procedure, with efficiency rates observed in subgroup G1 AE being similar
to groups FIV or TNCS / Na clonagem por transferência nuclear com célula somática (TNCS), o tipo de citoplasto
receptor desempenha papel chave na reprogramação nuclear. Distintos citoplastos e
carioplastos e condições de ativação foram utilizadas na reconstrução de embriões bovinos
com o objetivo de avaliar o efeito do tipo de citoplasto (oócito e/ou zigoto) e do método de
ativação (química, AQ, ou espermática, AE) no desenvolvimento de blastocistos clonados
produzidos pela técnica de clonagem manual (Handmade Cloning, HMC). Após 17 h de
maturação in vitro (MIV), 2.946 oócitos foram enucleados por bissecção manual, resultando
em hemi-oócitos enucleados (citoplastos MII) e não enucleados (carioplastos MII). Outros
2.368 oócitos submetidos a 6 h de fecundação in vitro (FIV) foram bisseccionados
manualmente e segregados em hemi-zigotos enucleados (citoplastos FIV) e não enucleados
(carioplastos FIV). Células de um cultivo celular estabelecido a partir da biópsia auricular de
uma fêmea bovina adulta foram utilizadas como núcleos doadores (carioplasto CS). As
estruturas foram dispostas em (a) grupos controle: FIV; partenogênese com oócitos com (PG
c/) ou sem zona pelúcida (PG s/); e clone por TNCS; ou (b) grupos experimentais: G1,
citoplasto FIV + citoplasto MII + carioplasto CS; G2, citoplasto MII + carioplasto FIV; G3,
citoplasto FIV + carioplasto FIV; G4, citoplasto FIV + citoplasto FIV + carioplasto CS; e G5,
citoplasto MII + carioplasto MII. Após a eletrofusão das estruturas, os grupos experimentais
G1 a G45 foram divididos em subgrupos de AQ ou AE. O cultivo in vitro foi realizado pelo
sistema WOW (well-of-the-well). Após 20 repetições, as taxas de clivagem (D2) e blastocisto
(D7) foram comparadas pelos testes de χ2 e os valores para o número total de células e a
alocação das linhagens celulares nos blastocistos, determinados por coloração diferencial,
foram avaliados por análise de variância, com pareamento comparativo pelo teste de Tukey,
para P<0,05. O único grupo experimental que apresentou desenvolvimento embrionário no
D7 semelhante aos controles FIV (27,0%) e TNCS (31,4%) foi o subgrupo G1 AE (28,2%).
Isso pode ser atribuído a uma melhor sincronia do ciclo celular entre citoplastos e/ou
carioplasto e um mais adequado processo de ativação. O desenvolvimento embrionário nos
grupos G1 AQ (13,7%), G4 AQ (6,4%) e G4 AE (8,7%) foi menor do que o G1 AE,
possivelmente devido à assincronia do processo de ativação ou ciclo celular. O
desenvolvimento embrionário nulo dos grupos G2 e G3, independente da ativação,
possivelmente foi decorrente da manipulação das estruturas em um momento biologicamente
sensível. Da mesma forma, a baixa clivagem (57,0%) e o desenvolvimento nulo no grupo G5
de ativação espontânea demonstraram de fato que a manipulação estimulou o processo de
ativação embrionária de forma sub-limiar. Em geral, não houve diferença no número de
células e alocação celular nos grupos onde houve desenvolvimento até o estádio de
blastocisto. Conclui-se que o processo de ativação foi tão significativo para o
desenvolvimento embrionário que o tipo de citoplasto e carioplasto usados na reconstrução
embrionária. A produção de embriões clones com um método mais fisiológico de ativaçao
(AE) mostrou-se como um procedimento viável, obtendo-se no grupo G1 AE a mesma
eficiência observada na FIV ou na TNCS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/892 |
| Date | 25 September 2009 |
| Creators | Mezzalira, Joana Claudia |
| Contributors | Bertolini, Marcelo |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Ciência Animal, UDESC, BR, Ciências Veterinárias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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