Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Early diagnosis of leprosy is an important contribution to reducing the incidence of the
disease. For its early detection, the development of new platforms that include the
mapping of antigens with potential to be used in immunodiagnostic is of great interest.
Among these antigens, the PGL-1 and epitopes derived from specific bacillus proteins
have received great attention. Alternatively, due to their versatility to perform the same
functions as the protein and non-protein natural antigens, mimetic peptides are considered
an important tool. Thus, our goal was to produce mimetic peptides of Mycobacterium
leprae antigens that are promising as serological markers, which will be explored in new
diagnostic platforms. To produce peptide mimetics, phage display technology was used. In
the first case, we used a monoclonal anti-PGL-1 (CS-38) aiming to obtain peptides that
mimics the PGL-1. In the second case, the peptides were obtained having purified IgGs
from patients with leprosy as target. The sequences of the selected peptides expressed on
the phage surface were chemically synthesized. The synthetic peptides were validated by
ELISA (case 1 and 2) and by an immunosensor based on Surface Plasmon Resonance
(case 1). Aiming to confirm and identify the targets of the mimetic peptides, scFv
antibodies were produced by reverse engineering. The PGL-1-M3 peptide that mimics the
native PGL-1 had a sensitivity of 89.11% and specificity of 100.00% in the IgM detection,
with positivity of 100% in lepromatous (LL). The IgG detection had positivity of 60% for
tuberculoid (TT) and 39% for household contacts (HC). This peptide was used in
assembling one biophotonics platform, which allowed the differentiation of all forms of
leprosy (p <0.05). The anti-scFv-M3 PGL-1 recognized native PGL-1 and accurately
detected the M. leprae in immunohistochemistry tests. The MPML11, MPML14 and
MPML12 peptides that mimics M. leprae antigens detect IgG and IgA in patients and HC.
In IgG detection, MPML11 peptide showed positivity in 52.2% of TT and 35% of HC, and is
also a promising marker of type 2 reaction. MPML12 and MPML14 peptides showed a
very similar behavior to the PGL-1, with positivity of 100% and 92.85% in LL, respectively.
The three peptides detected IgA in the serum of patients, especially multibacillary (MBs);
and IgA in saliva of MBs and HC which index case was multibacillary. Mimetic peptides
obtained in this work were confirmed as true mimetics of M. leprae antigens and can be
applied in the diagnosis of leprosy in different platforms. / O diagnóstico precoce da hanseníase representa uma contribuição importante para
diminuir a incidência da doença. Para isso é fundamental o desenvolvimento de novas
plataformas, que incluam o mapeamento de antígenos com potencial para o
imunodiagnóstico. Dentre estes destaca-se o PGL-1 e epítopos obtidos de proteínas
específicas do bacilo. Alternativamente, peptídeos miméticos apresentam-se como uma
importante ferramenta, pela versatilidade em desempenhar as mesmas funções que os
antígenos naturais proteicos e não-proteicos. Dessa forma, nosso objetivo foi produzir
peptídeos miméticos a antígenos do Mycobacterium leprae e que sejam promissores
como marcadores sorológicos, os quais serão explorados em novas plataformas
diagnósticas. Para produzir os peptídeos miméticos foi utilizada a tecnologia phage
display. No primeiro processo utilizou-se um anticorpo monoclonal anti-PGL-1 (CS-38)
para obter peptídeos miméticos ao PGL-1. No segundo processo, os peptídeos foram
produzidos tendo como alvo IgGs purificadas de pacientes com hanseníase. As
sequências dos peptídeos expressos nos fagos foram sintetizadas quimicamente. Os
peptídeos sintéticos foram validados por ELISA (processo 1 e 2) e imunosensor baseado
em Ressonância Plasmônica de Superfície (processo 1). Por meio de engenharia reversa,
anticorpos scFv foram produzidos para confirmar e identificar alvos dos peptídeos
miméticos. O peptídeo PGL-1-M3 mimético ao PGL-1 nativo apresentou sensibilidade de
89,11% e especificidade de 100,00% na detecção de IgM, com positividade de 100% em
lepromatosos (LL), bem como títulos de IgG detectaram positividade de 60% para
tuberculóides (TT) e 39% para contatos domiciliares (HC). Com este peptídeo foi montada
uma plataforma biofotônica, que diferencia todas as formas clínicas de hanseníase
(p<0,05). O scFv anti-PGL-1-M3 reconheceu PGL-1 nativo e detectou com precisão o M.
leprae na imuno-histoquímica. Os peptídeos MPML11, MPML12 e MPML14 miméticos de
antígenos do M.leprae detectam IgG e IgA em pacientes e HC. Na detecção de IgG,
MPML11 apresentou positividade de 52,2% em TT e 35% em HC e também é um
promissor marcador de reação tipo 2. MPML12 e MPML14 apresentaram um
comportamento muito similar ao PGL-1, tendo 100% e 92,85% de positividade em LL,
respectivamente. Os três peptídeos detectaram IgA nos soros de pacientes,
especialmente multibacilares (MBs); bem como IgA na saliva de MBs e HC cujo caso
índice era multibacilar. Os peptídeos miméticos obtidos nesse trabalho foram confirmados
como miméticos verdadeiros de antígenos do M. leprae e podem ser aplicados no
diagnóstico da hanseníase em diferentes plataformas. / Doutor em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15760 |
| Date | 11 March 2015 |
| Creators | Lima, Mayara Ingrid Sousa |
| Contributors | Goulart Filho, Luiz Ricardo, Moraes, Milton Ozório, Cunha Junior, Jair Pereira da, Silva, Robinson Sabino da, Stefani, Mariane Martins de Araújo |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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