Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SergioRFA_TESE.pdf: 7822699 bytes, checksum: 8e76eaff31bfe4bd8789eb8d81e15701 (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / O tropismo do M. leprae pela pele e nervos perif?ricos, confere ? hansen?ase caracter?sticas peculiares, tais como perda de sensibilidade e deformidades teciduais. Hipotetizamos que a susceptibilidade do hospedeiro ? gerida por um complexo conjunto de fatores diferentes, como aumento da express?o dos genes ERBB2, PARK2 e PACRG e/ou o ganho de atividade dos seus produtos g?nicos, em virtude de polimorfismos nesses genes. Outro fator que hipotetizamos estar contribuindo com a susceptibilidade ? hansen?ase, juntamente com os fatores gen?ticos, ? a exist?ncia de elementos de risco entre pessoas suscept?veis, tais como, co-morbidades e exposi??o prolongada ao pat?geno. Tamb?m hipotetizamos que a distribui??o desigual da doen?a em algumas ?reas populacionais, com forma??o de aglomerados, seja devido, a elevada densidade populacional de pessoas suscept?veis em ?reas de risco por tempo prolongado. Portanto, para comprovar essas hip?teses tem-se os seguintes objetivos: 1) Testar o envolvimento de polimorfismos nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG com a hansen?ase em duas ?reas end?micas, mas com popula??es distintas; 2) Testar a rela??o de fatores de risco exposicionais e co-morbidades, dentre outros, com o aumento de susceptibilidade ? hansen?ase na popula??o do Rio Grande do Norte e 3) Avaliar se fatores como densidade demogr?fica e padr?o socioecon?mico e sanit?rio est?o contribuindo com a desigual distribui??o da doen?a em ?rea end?mica para a hansen?ase no estado do Rio Grande do Norte. Este estudo foi desenvolvido em 3 etapas: Foram genotipados marcadores no gene ERBB2 na popula??o de Bel?m/PA, usando uma abordagem familiar. Num segundo momento foram genotipados marcadores nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG na popula??o do Rio Grande do Norte, usando uma abordagem caso-controle. Num terceiro momento, foi avaliada a distribui??o espacial da hansen?ase em Nova Cruz/RN. Foram feitas an?lises in silico, que apontaram para uma muta??o delet?ria no gene ERBB2 (rs1058808) e outra no gene PARK2 (rs1801334). Atrav?s de an?lise de modelagem molecular tamb?m foi encontrada uma muta??o potencialmente capaz de alterar a fun??o da prote?na ErbB2 (rs1801200). A genotipagem da popula??o de Bel?m/PA mostrou como fatores de risco dentre as fam?lias analisadas os polimorfismos rs2517956 e rs1058808 no gene ERBB2. Na genotipagem da popula??o do Rio Grande do Norte, encontramos como fatores de risco, os polimorfismos rs6915128 e rs1801334 para a hansen?ase per se e suas formas cl?nicas e rs1333955 para o ENH. Encontramos dois fatores de risco que justificaram a distribui??o desigual dos casos de hansen?ase na cidade de Nova Cruz/RN, a elevada densidade demogr?fica e o maior tempo de moradia de pessoas suscept?veis em ?reas de risco. Os genes PARK2, PACRG e ERBB2 participam da patog?nese da hansen?ase e, portanto s?o s?rios candidatos a alvos para agentes terap?uticos. Nesse estudo foi encontrado um SNP que tamb?m j? havia sido associado ao mal de Parkinson, e portanto, pode haver um compartilhamento funcional da parquina entre a hansen?ase e o Parkinsonismo. Nesse estudo tamb?m foi encontrado pela primeira vez associa??o entre variantes gen?ticas de ERBB2 e a hansen?ase

Leprosy is an important health problem in Brazil, with a high detection rate despite the application of the multidrug therapy. The nasal mucosa is considered the preferential site of entry and exit of the Mycobacterium leprae, although some lesions have been found in the buccal mucosa. However, the buccal mucosa involvement in bacilli transmission has never been investigated. We have shown the presence of the M. leprae DNA in buccal swabs of leprosy patients (334) and household contacts (1288) through conventional polymerase chain reaction (PCR), and results were correlated with clinical and other laboratorial evaluations. The overall positivity for patients was 18.26%, divided into 12.03% and 21.23% for paucibacillary and multibacillary forms, respectively. Among contacts, the positivity reached 6.83%, which were considered either as healthy carriers or sub-clinically infected, when the ELISA test presented a positive anti-PGL-1 result. This study showed important evidences that the buccal mucosa may be a secondary site of M. leprae transmission and infection. Furthermore, contacts with positive PCR may be actively involved in the transmission. Our findings have great epidemiological relevance, especially for the leprosy control programs and for the dentistry clinics, and must be considered in the new strategies of control and prevention. / A hanseníase é um importante problema de saúde pública no Brasil, com elevada taxa de detecção, apesar da aplicação da poliquimioterapia. A mucosa nasal é considerada o local preferencial de entrada e saída do Mycobacterium leprae, embora algumas lesões tenham sido encontradas na mucosa bucal. No entanto, o envolvimento da mucosa oral na transmissão do bacilo nunca foi investigado. Nós mostramos a presença do DNA do M. leprae em swab bucal de pacientes com hanseníase (334) e contatos domiciliares (1288) por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, e os resultados foram correlacionados com outras avaliações clínica e laboratorial. A positividade geral de pacientes foi de 18,26%, dividida em 12,03% e 21,23% para as formas paucibacilares e multibacilares, respectivamente. Entre os contatos, a positividade alcançou 6,83%, que foram considerados como portadores sadios ou infectados subclínicos, quando o teste ELISA anti-PGL-1 apresentou resultado positivo. Este estudo mostrou evidências importantes de que a mucosa bucal pode ser um sítio secundário de infecção e transmissão do M. leprae. Além disso, contatos com PCR positivo podem estar envolvidos ativamente na transmissão. Nossos resultados têm grande relevância epidemiológica, especialmente para os programas de controle da hanseníase e para as clínicas de odontologia, e devem ser considerados em novas estratégias de controle e prevenção. / Mestre em Ciências da Saúde

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Early diagnosis of leprosy is an important contribution to reducing the incidence of the disease. For its early detection, the development of new platforms that include the mapping of antigens with potential to be used in immunodiagnostic is of great interest. Among these antigens, the PGL-1 and epitopes derived from specific bacillus proteins have received great attention. Alternatively, due to their versatility to perform the same functions as the protein and non-protein natural antigens, mimetic peptides are considered an important tool. Thus, our goal was to produce mimetic peptides of Mycobacterium leprae antigens that are promising as serological markers, which will be explored in new diagnostic platforms. To produce peptide mimetics, phage display technology was used. In the first case, we used a monoclonal anti-PGL-1 (CS-38) aiming to obtain peptides that mimics the PGL-1. In the second case, the peptides were obtained having purified IgGs from patients with leprosy as target. The sequences of the selected peptides expressed on the phage surface were chemically synthesized. The synthetic peptides were validated by ELISA (case 1 and 2) and by an immunosensor based on Surface Plasmon Resonance (case 1). Aiming to confirm and identify the targets of the mimetic peptides, scFv antibodies were produced by reverse engineering. The PGL-1-M3 peptide that mimics the native PGL-1 had a sensitivity of 89.11% and specificity of 100.00% in the IgM detection, with positivity of 100% in lepromatous (LL). The IgG detection had positivity of 60% for tuberculoid (TT) and 39% for household contacts (HC). This peptide was used in assembling one biophotonics platform, which allowed the differentiation of all forms of leprosy (p <0.05). The anti-scFv-M3 PGL-1 recognized native PGL-1 and accurately detected the M. leprae in immunohistochemistry tests. The MPML11, MPML14 and MPML12 peptides that mimics M. leprae antigens detect IgG and IgA in patients and HC. In IgG detection, MPML11 peptide showed positivity in 52.2% of TT and 35% of HC, and is also a promising marker of type 2 reaction. MPML12 and MPML14 peptides showed a very similar behavior to the PGL-1, with positivity of 100% and 92.85% in LL, respectively. The three peptides detected IgA in the serum of patients, especially multibacillary (MBs); and IgA in saliva of MBs and HC which index case was multibacillary. Mimetic peptides obtained in this work were confirmed as true mimetics of M. leprae antigens and can be applied in the diagnosis of leprosy in different platforms. / O diagnóstico precoce da hanseníase representa uma contribuição importante para diminuir a incidência da doença. Para isso é fundamental o desenvolvimento de novas plataformas, que incluam o mapeamento de antígenos com potencial para o imunodiagnóstico. Dentre estes destaca-se o PGL-1 e epítopos obtidos de proteínas específicas do bacilo. Alternativamente, peptídeos miméticos apresentam-se como uma importante ferramenta, pela versatilidade em desempenhar as mesmas funções que os antígenos naturais proteicos e não-proteicos. Dessa forma, nosso objetivo foi produzir peptídeos miméticos a antígenos do Mycobacterium leprae e que sejam promissores como marcadores sorológicos, os quais serão explorados em novas plataformas diagnósticas. Para produzir os peptídeos miméticos foi utilizada a tecnologia phage display. No primeiro processo utilizou-se um anticorpo monoclonal anti-PGL-1 (CS-38) para obter peptídeos miméticos ao PGL-1. No segundo processo, os peptídeos foram produzidos tendo como alvo IgGs purificadas de pacientes com hanseníase. As sequências dos peptídeos expressos nos fagos foram sintetizadas quimicamente. Os peptídeos sintéticos foram validados por ELISA (processo 1 e 2) e imunosensor baseado em Ressonância Plasmônica de Superfície (processo 1). Por meio de engenharia reversa, anticorpos scFv foram produzidos para confirmar e identificar alvos dos peptídeos miméticos. O peptídeo PGL-1-M3 mimético ao PGL-1 nativo apresentou sensibilidade de 89,11% e especificidade de 100,00% na detecção de IgM, com positividade de 100% em lepromatosos (LL), bem como títulos de IgG detectaram positividade de 60% para tuberculóides (TT) e 39% para contatos domiciliares (HC). Com este peptídeo foi montada uma plataforma biofotônica, que diferencia todas as formas clínicas de hanseníase (p<0,05). O scFv anti-PGL-1-M3 reconheceu PGL-1 nativo e detectou com precisão o M. leprae na imuno-histoquímica. Os peptídeos MPML11, MPML12 e MPML14 miméticos de antígenos do M.leprae detectam IgG e IgA em pacientes e HC. Na detecção de IgG, MPML11 apresentou positividade de 52,2% em TT e 35% em HC e também é um promissor marcador de reação tipo 2. MPML12 e MPML14 apresentaram um comportamento muito similar ao PGL-1, tendo 100% e 92,85% de positividade em LL, respectivamente. Os três peptídeos detectaram IgA nos soros de pacientes, especialmente multibacilares (MBs); bem como IgA na saliva de MBs e HC cujo caso índice era multibacilar. Os peptídeos miméticos obtidos nesse trabalho foram confirmados como miméticos verdadeiros de antígenos do M. leprae e podem ser aplicados no diagnóstico da hanseníase em diferentes plataformas. / Doutor em Genética e Bioquímica

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole. The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL), and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M. leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1 have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance. Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable, differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other human antibodies. The serological tests of household contacts for this same phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina (inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo, contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5% de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica