Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole. The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL), and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M. leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1 have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance. Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable, differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other human antibodies. The serological tests of household contacts for this same phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina (inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo, contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5% de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Human strongyloidiasis is an important intestinal parasitic infection worldwide, 50% of infected individuals are asymptomatic, however it can cause hyper infection and dissemination in immunocompromised hosts leading to death. Early detection of the disease prevents the development of hyper infection and dissemination syndromes, so the use of an efficient diagnostic tool has great importance to identify and control this parasitic disease. Due to the lack of efficiency in parasitological and serological tests currently available to detect human strongyloidiasis it is necessary to improve immunodiagnostic tests using recombinant and synthetic antigens once there are limitations to obtain and use homologous antigens produced from the parasite. The aim of this study was to select using phage display technology Strongyloides stercoralis mimetic peptides ligands to immunoglobulin G from patients with strongyloidiasis. The PhDTM-C7C library was used in the selection process and the DNA of the selected clones was extracted, sequenced and analyzed using bioinformatics tools. ELISA tests were done by using five distinct phage clones, which presented significant similarity with proteins from S. stercoralis, and the two synthetic peptides corresponding to the sequences displayed on two phage clones. Binding specificity of each phage clone to the pool of sera from patients with strongyloidiasis was analyzed by competitive ELISA. Sensitivity, specificity, diagnostic efficiency, area under curve and likelihood ratio were calculated for each antigen. All phage clones presented high diagnostic potential achieving area under curves higher than 0.8, the C9 clone presented reasonable sensitivity (87.5%), specificity (80%) and diagnostic efficiency (82.5%).Synthetic peptides C10 and D3 showed superior diagnostic performance, with areas under the curve greater than 0.9 and excellent sensitivity (95%, 95%), specificity (86.3%, 92.5%) and diagnostic efficiency (89 2%, 93.3%) respectively. It was concluded that the selected peptides by Phage display can mimic S. stercoralis epitopes and represent promising alternative to the currently available antigens for human strongyloidiasis diagnosis. / Estrongiloidiase humana é uma importante parasitose intestinal em todo mundo, 50% das pessoas infectadas são assintomáticas, entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação em pacientes imunocomprometidos, levando à morte. A detecção precoce da doença previne o desenvolvimento das síndromes de hiperinfecção e disseminação, assim, o uso de uma ferramenta diagnóstica eficiente é de grande importância para identificar e controlar esta parasitose. Devido à falta de eficiência nos testes parasitológicos e sorológicos disponíveis atualmente para detectar estrongiloidiase humana é necessário aprimorar os testes imunodiagnósticos utilizando antígenos recombinantes e sintéticos, uma vez que há limitações para obter e utilizar antígenos homólogos, produzidos a partir do parasito. O objetivo deste trabalho foi selecionar por Phage display peptídeos miméticos a Strongyloides stercoralis ligantes a imunoglobulinas G de pacientes com estrongiloidiase. Uma biblioteca PhDTM-C7C foi utilizada no processo de seleção e o DNA dos clones selecionados foi extraído, sequenciado e analisado por ferramentas de bioinformática. Os testes ELISA foram feitos utilizando cinco clones de fagos distintos, os quais tiveram similaridades significantes com proteínas de S. stercoralis, e dois peptídeos sintéticos correspondentes às sequências expressas por dois clones selecionados. A especificidade de ligação de cada clone de fago ao pool de soros de pacientes com estrongiloidiase foi analisada por ELISA de competição. Sensibilidade, especificidade, eficiência diagnóstica, áreas sob a curva e razão de verossimilhança foram calculados para cada antígeno. Todos os clones de fagos analisados apresentaram alto potencial diagnóstico alcançando área sob a curva maiores que 0,8, se destacando o clone C9 com razoável sensibilidade (87,5%), especificidade (80%) e eficiência de diagnóstica (82,5%). Os peptídeos sintéticos C10 e D3 apresentaram desempenho diagnóstico superior, com áreas sob a curva maiores que 0,9 e excelente sensibilidade (95%, 95%), especificidade (86,3%, 92,5%) e eficiência de diagnóstica (89,2%, 93,3%) respectivamente. Concluiu-se que os peptídeos selecionados por Phage display podem mimetizar epitopos de S. stercoralis e representam alternativa promissora aos antígenos atualmente disponíveis para utilização no diagnóstico da estrongiloidiase humana. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas