Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-21T19:19:10Z No. of bitstreams: 1 AnaDias.pdf: 3102283 bytes, checksum: 6eb4c0bb2a542e274e68001ba7b1b766 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T19:19:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaDias.pdf: 3102283 bytes, checksum: 6eb4c0bb2a542e274e68001ba7b1b766 (MD5) Previous issue date: 2016-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Apoio à Pequisa (FUNAPE) / Leishmaniasis is a neglected and endemic disease in Brazil, especially in the Northeast, caused by over 20 species of the Leishmania protozoan. Diagnosis includes epidemiological, clinical, and laboratory aspects. Despite the existence of various diagnostic techniques that can be used, none has 100% sensitivity and specificity. Hence, this study aimed to validate three recombinant mimetic peptides (LC1, LC2, and LT) obtained by Phage display, for the development of a specific, sensitive, rapid low-cost immunological diagnosis. Sera for detection of IgG from 223 individuals were used (123 with visceral leishmaniasis (VL), 45 with cutaneous leishmaniasis (CL) and 55 with LV-HIV coinfection). For cross-reaction tests, we used samples of patients with Chagas' disease (n = 60) and Malaria (n=65), and control group (n= 75 sera from newborns). The peptides were also tested in saliva from patients with LV (n = 65), with LT (n = 40), and healthy individuals from an endemic area were used as control (n =35). Diagnostic tests using the mimetic LC1 and LC2 peptides were carried out in serum of 15 asymptomatic subjects; 13 healed individuals and 15 healthy subjects. To test the ability of the mimetic peptides to improve the immune response against Leishmania, murine macrophages C57BL/6 were treated in vitro with peptides LC1, LC2, and LT (0,6μM; 1,25μM; 2,5μM; 5μM, 10μM) and infected with L. infantum chagasi and L. amazonensis for invasion and multiplication assays. We also evaluated the potential protective action of mimetic peptide in mice infected with L. amazonensis. Therefore, animals were immunized and the parasite load, expression of cytokines, lesion size, and protein analysis binders were evaluated. The immunoassays showed that both serum and saliva of the patients exhibited a highly significant difference (p < 0.0001) compared to their controls, with 100% sensitivity and 100%specificity. Peptides were able to detect infection in asymptomatic subjects and showed no cross-reactivity to either Chagas’ disease or malaria, as well as co-infection LV-HIV did not interfere with responsiveness to LV antibodies, therefore being a promising tool for monitoring regions where these diseases occur. Tests using macrophages showed a highly significant reduction in the number of infected cells and of internalized parasites. A further reduction of parasites with increasing concentration of peptide was observed. Furthermore, it was observed that immunization of mice was able to induce high levels of IFN-γ, IL-12, GM-CSF and IL-10, while IL-4 did not change compared to the control. Additionally, immunized animals showed a reduction in parasitic load in all organs (spleen, lymph node, liver, and bone marrow), a decrease in paw lesion in which parasites were inoculated and phosphorylation of ERK1/2, JNK and p65/RelA. Western Blot assay identified two proteins to L. amazonensis (42 KDa) and two to Leishmania infantum chagasi (26 KDa). Thus, our results demonstrate that mimetic peptides act as antigens of L. infantum chagasi and L. amazonensis, being good immune markers for a simple and fast diagnosis with high sensitivity and specificity. Finally, data in murine macrophages in vitro and in vivo open perspectives for their use as a vaccine tool. / Leishmaniose é uma doença negligenciada e endêmica no Brasil, especialmente na região Nordeste, sendo causada por cerca de 20 espécies do protozoário Leishmania. O diagnóstico abrange aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. Apesar de existir várias técnicas diagnósticas que podem ser utilizadas, nenhum dos testes disponíveis apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Baseado nisto, este trabalho se propôs a validar três peptídeos recombinantes miméticos (LC1, LC2 e LT) obtidos por Phage display, para o desenvolvimento de um diagnóstico imunológico rápido, específico, sensível e de baixo custo. Foram utilizados soros para detecção de IgG em 223 indivíduos, sendo 123 com leishmaniose visceral (LV), 45 com leishmaniose tegumentar (LT) e 55 com coinfecção LV-HIV. Para testes de reação cruzada, foram utilizadas amostras de pacientes com Doença de Chagas (n = 60) e com Malária (n = 65) e, como grupo controle, foram utilizados soros de 75 de recém-nascidos. Os peptídeos também foram testados em amostras de saliva de 65 pacientes com LV e 40 pacientes com LT, tendo como grupo controle 35 indivíduos saudáveis de área endêmica. Foram realizados também testes diagnósticos utilizando os peptídeos miméticos LC1 e LC2 em soro de 15 indivíduos assintomáticos; 13 indivíduos curados e 15 indivíduos sadios. Com a finalidade vacinal, macrófagos murinos C57BL/6 foram tratados in vitro com peptídeos LC1, LC2 e LT (0,6μM; 1,25μM; 2,5μM; 5μM; 10μM) e infectados com L. infantum chagasi e L. amazonensis para ensaio de invasão e multiplicação. Foram também realizados ensaios para testar o potencial protetor do peptídeo mimético em camundongos infectados por L. amazonensis. Para tanto, os animais foram imunizados e avaliada a carga parasitária, expressão de citocinas, tamanho da lesão, e análise protéica de ligantes. Os ensaios imunoenzimáticos mostraram que tanto soro quanto saliva dos pacientes apresentaram diferença altamente significativa (p < 0,0001) em relação a seus controles, apresentando sensibilidade de 100% e especificidade de 100% para todos os peptídeos, tanto em soro quanto em saliva. Os peptídeos foram capazes de detectar infecção em indivíduos assintomáticos e não apresentaram reação cruzada com Doença de Chagas e Malária, bem como a coinfecção com HIV não interfere na reatividade com os anticorpos para L. infantum chagasi, sendo, portanto, uma promissora ferramenta para monitoramento da infecção em regiões endêmicas. Os ensaios com macrófagos mostraram uma redução altamente significativa no número de células infectadas e do número de parasitas internalizados. Observou-se maior redução de parasitas com o aumento da concentração dos peptídeos. Foi observado que a imunização de camundongos foi capaz de induzir níveis elevados de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF, enquanto os níveis de IL-4 e IL-10 foram reduzidos. Além disso, os animais imunizados apresentaram uma redução da carga parasitária em todos os órgãos (baço, linfonodo, fígado e medula óssea), uma diminuição da lesão da pata na qual os parasitas foram inoculados e fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK e p65/RelA. O ensaio Western Blot identificou duas proteínas de L. amazonensis (42 kDa) e duas para Leishmania infantum chagasi (26 kDa). Assim, os resultados demonstram que os peptídeos sintéticos mimetizam antígenos de L. amazonensis e L. infantum chagasi, revelando-se bons marcadores para diagnóstico imunológico de uso rápido, simples e, principalmente, com alta sensibilidade e especificidade. Finalmente, os dados em macrófagos murinos in vitro e in vivo abrem perspectivas para o uso desses peptídeos como ferramenta vacinal.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole. The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL), and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M. leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1 have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance. Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable, differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other human antibodies. The serological tests of household contacts for this same phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina (inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo, contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5% de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica