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Validação de peptídeos miméticos recombinantes como ferramenta diagnóstica e vacinal para leishmaniose humana / VALIDATION OF PEPTIDES MIMETIC RECOMBINANT AS DIAGNOSTIC TOOL AND VACCINE FOR HUMAN LEISHMANIASISDias, Ana Carolina Soares 21 June 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Apoio à Pequisa (FUNAPE) / Leishmaniasis is a neglected and endemic disease in Brazil, especially in the Northeast, caused by over 20 species of the Leishmania protozoan. Diagnosis includes epidemiological, clinical, and laboratory aspects. Despite the existence of various diagnostic techniques that can be used, none has 100% sensitivity and specificity. Hence, this study aimed to validate three recombinant mimetic peptides (LC1, LC2, and LT) obtained by Phage display, for the development of a specific, sensitive, rapid low-cost immunological diagnosis. Sera for detection of IgG from 223 individuals were used (123 with visceral leishmaniasis (VL), 45 with cutaneous leishmaniasis (CL) and 55 with LV-HIV coinfection). For cross-reaction tests, we used samples of patients with Chagas' disease (n = 60) and Malaria (n=65), and control group (n= 75 sera from newborns). The peptides were also tested in saliva from patients with LV (n = 65), with LT (n = 40), and healthy individuals from an endemic area were used as control (n =35). Diagnostic tests using the mimetic LC1 and LC2 peptides were carried out in serum of 15 asymptomatic subjects; 13 healed individuals and 15 healthy subjects. To test the ability of the mimetic peptides to improve the immune response against Leishmania, murine macrophages C57BL/6 were treated in vitro with peptides LC1, LC2, and LT (0,6μM; 1,25μM; 2,5μM; 5μM, 10μM) and infected with L. infantum chagasi and L. amazonensis for invasion and multiplication assays. We also evaluated the potential protective action of mimetic peptide in mice infected with L. amazonensis. Therefore, animals were immunized and the parasite load, expression of cytokines, lesion size, and protein analysis binders were evaluated. The immunoassays showed that both serum and saliva of the patients exhibited a highly significant difference (p < 0.0001) compared to their controls, with 100% sensitivity and 100%specificity. Peptides were able to detect infection in asymptomatic subjects and showed no cross-reactivity to either Chagas’ disease or malaria, as well as co-infection LV-HIV did not interfere with responsiveness to LV antibodies, therefore being a promising tool for monitoring regions where these diseases occur. Tests using macrophages showed a highly significant reduction in the number of infected cells and of internalized parasites. A further reduction of parasites with increasing concentration of peptide was observed. Furthermore, it was observed that immunization of mice was able to induce high levels of IFN-γ, IL-12, GM-CSF and IL-10, while IL-4 did not change compared to the control. Additionally, immunized animals showed a reduction in parasitic load in all organs (spleen, lymph node, liver, and bone marrow), a decrease in paw lesion in which parasites were inoculated and phosphorylation of ERK1/2, JNK and p65/RelA. Western Blot assay identified two proteins to L. amazonensis (42 KDa) and two to Leishmania infantum chagasi (26 KDa). Thus, our results demonstrate that mimetic peptides act as antigens of L. infantum chagasi and L. amazonensis, being good immune markers for a simple and fast diagnosis with high sensitivity and specificity. Finally, data in murine macrophages in vitro and in vivo open perspectives for their use as a vaccine tool. / Leishmaniose é uma doença negligenciada e endêmica no Brasil, especialmente na região Nordeste, sendo causada por cerca de 20 espécies do protozoário Leishmania. O diagnóstico abrange aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. Apesar de existir várias técnicas diagnósticas que podem ser utilizadas, nenhum dos testes disponíveis apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Baseado nisto, este trabalho se propôs a validar três peptídeos recombinantes miméticos (LC1, LC2 e LT) obtidos por Phage display, para o desenvolvimento de um diagnóstico imunológico rápido, específico, sensível e de baixo custo. Foram utilizados soros para detecção de IgG em 223 indivíduos, sendo 123 com leishmaniose visceral (LV), 45 com leishmaniose tegumentar (LT) e 55 com coinfecção LV-HIV. Para testes de reação cruzada, foram utilizadas amostras de pacientes com Doença de Chagas (n = 60) e com Malária (n = 65) e, como grupo controle, foram utilizados soros de 75 de recém-nascidos. Os peptídeos também foram testados em amostras de saliva de 65 pacientes com LV e 40 pacientes com LT, tendo como grupo controle 35 indivíduos saudáveis de área endêmica. Foram realizados também testes diagnósticos utilizando os peptídeos miméticos LC1 e LC2 em soro de 15 indivíduos assintomáticos; 13 indivíduos curados e 15 indivíduos sadios. Com a finalidade vacinal, macrófagos murinos C57BL/6 foram tratados in vitro com peptídeos LC1, LC2 e LT (0,6μM; 1,25μM; 2,5μM; 5μM; 10μM) e infectados com L. infantum chagasi e L. amazonensis para ensaio de invasão e multiplicação. Foram também realizados ensaios para testar o potencial protetor do peptídeo mimético em camundongos infectados por L. amazonensis. Para tanto, os animais foram imunizados e avaliada a carga parasitária, expressão de citocinas, tamanho da lesão, e análise protéica de ligantes. Os ensaios imunoenzimáticos mostraram que tanto soro quanto saliva dos pacientes apresentaram diferença altamente significativa (p < 0,0001) em relação a seus controles, apresentando sensibilidade de 100% e especificidade de 100% para todos os peptídeos, tanto em soro quanto em saliva. Os peptídeos foram capazes de detectar infecção em indivíduos assintomáticos e não apresentaram reação cruzada com Doença de Chagas e Malária, bem como a coinfecção com HIV não interfere na reatividade com os anticorpos para L. infantum chagasi, sendo, portanto, uma promissora ferramenta para monitoramento da infecção em regiões endêmicas. Os ensaios com macrófagos mostraram uma redução altamente significativa no número de células infectadas e do número de parasitas internalizados. Observou-se maior redução de parasitas com o aumento da concentração dos peptídeos. Foi observado que a imunização de camundongos foi capaz de induzir níveis elevados de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF, enquanto os níveis de IL-4 e IL-10 foram reduzidos. Além disso, os animais imunizados apresentaram uma redução da carga parasitária em todos os órgãos (baço, linfonodo, fígado e medula óssea), uma diminuição da lesão da pata na qual os parasitas foram inoculados e fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK e p65/RelA. O ensaio Western Blot identificou duas proteínas de L. amazonensis (42 kDa) e duas para Leishmania infantum chagasi (26 kDa). Assim, os resultados demonstram que os peptídeos sintéticos mimetizam antígenos de L. amazonensis e L. infantum chagasi, revelando-se bons marcadores para diagnóstico imunológico de uso rápido, simples e, principalmente, com alta sensibilidade e especificidade. Finalmente, os dados em macrófagos murinos in vitro e in vivo abrem perspectivas para o uso desses peptídeos como ferramenta vacinal.
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Identificação e caracterização de peptídeos miméticos dos antígenos de Mycobacterium leprae por phage displayOliveira, Jaqueline das Dores Dias 22 February 2007 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated
immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole
to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole.
The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for
discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae
antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer
understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of
diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were
selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion
with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified
IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL),
and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine
elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic
analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For
the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL
pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes
were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most
frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were
coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL
pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT
pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with
incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented
the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of
these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and
therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M.
leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1
have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due
to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have
developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to
improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide
conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal
antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were
sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope
HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance.
Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the
synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together
with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results
were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable,
differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for
multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for
the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the
mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the
peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other
human antibodies. The serological tests of household contacts for this same
phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for
the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope
with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae
proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative
targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could
be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta
imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium
leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta
carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do
bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos
recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao
seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos
mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do
diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae
foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos
randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como
alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos
os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os
peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina
(inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após
análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e
alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo
tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano
apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos
para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais
freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram
coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais
freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais
freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima
citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e
o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de
pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no
desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle
da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente
específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os
testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de
anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo
importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver
peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma
de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de
heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos
ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones
foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo
HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os
peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em
comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a
forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus
casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos
pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas
intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente
do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A
forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo,
contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo
circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como
também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos
intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5%
de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É
provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar
identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser
analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do
PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias
diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica
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