Bacillus licheniformis P40 produz uma bacteriocina que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos entre os quais se destacam Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Erwinia carotovora. Estas substâncias possuem grande potencial biotecnológico que pode ser explorado pela indústria alimentícia. Assim sendo, este trabalho teve como objetivos a purificação e incorporação do peptídeo antimicrobiano em nanovesículas. A bacteriocina foi incorporada em nanovesículas de fosfatidilcolina, resultando em partículas de cerca de 570 nm. Houve Inibição completa do crescimento de L. monocytogenes com a adição de 100 e 50 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, respectivamente. Observou-se uma redução no número de células viáveis para zero após 12 minutos de incubação com 400 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, apresentando uma estabilidade de até 28 dias a 4ºC, para a forma encapsulada.O composto bacteriano foi purificado através de etapas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em Sephadex G-100 e cromatografia de fase reversa em Source-RPC. A purificação resultou num fator de 100 vezes com rendimento de 0.3%. A massa molecular do peptídeo foi determinado em cerca de 800 Da por espectrometria de massas. A bacteriocina étermo-resistente, suportando aquecimento a 100ºC por 5 minutos, e estável na faixa de pH de 6 a 10, porém sensível à ação de pronase E, butanol e ácido tricloroacético. O experimento realizado revelou ainda propriedades emulsificantes desta substância. Dados de espectroscopia de infravermelho indicaram uma estrutura molecular semelhante à de lipopeptídeos como, a surfactina e a lichenisina. Em relação à toxicidade frente a hemácias, em testes qualitativos, aferiram-se propriedades atóxicas, o que pode sugerir estudos mais detalhados sobre ensaios toxicológicos para uma provável utilização em produtos alimentícios. / Bacillus licheniformis P40 produces a bacteriocin that presents potential for use as biopreservative in the control of pathogenic and spoilage microorganisms like Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Erwinia carotovora. In that way, these substances present a biotechnological interest that it can be explored by the food industry. This work has as objectives the purification and incorporation of antimicrobial peptide into nanovesicles. The bacteriocin was incorporated in phopholipidic nanovesicles, resulting in particle size of about 570 nm. There was complete inhibition of the growth of L. monocytogenes with the addition of 100 and 50 UA.mL-1 of encapsulated and free bacteriocin, respectively. It was observed a reduction in the number of viable cells to zero after 12 minutes incubation with 400 UA.mL-1 of encapsulated or free bacteriocin, presenting a stability of until 28 days to 4ºC for the encapsulated form.The bacterial composition was purified through steps of precipitation with ammonium sulfate, gel-filtration chromatography in Sephadex G-100 and reverse phase chromatography Source-RPC. The purification factor was 100 fold with yield of 0.3%. The molecular mass of the peptide was determined as about 800 Da by mass spectrometry. The bacteriocin was heat resistant, supporting heating at 100ºC for 5 minutes, was stable at pH from 6 to 10, but sensitive to the action of pronase E, butanol and trichloroaceticacid. Accomplished experiment indicated the peptide has emulsifying properties. Infrared spectroscopy indicated a molecular structure similar to some lipopeptides like surfactin and lichenisin. In relation to the toxicity front erythrocytes, non-toxic properties were observedd, which indicate more detailed studies on toxicological rehearsals for a probable use in food products.

Bacillus licheniformis P40 produz uma bacteriocina que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos entre os quais se destacam Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Erwinia carotovora. Estas substâncias possuem grande potencial biotecnológico que pode ser explorado pela indústria alimentícia. Assim sendo, este trabalho teve como objetivos a purificação e incorporação do peptídeo antimicrobiano em nanovesículas. A bacteriocina foi incorporada em nanovesículas de fosfatidilcolina, resultando em partículas de cerca de 570 nm. Houve Inibição completa do crescimento de L. monocytogenes com a adição de 100 e 50 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, respectivamente. Observou-se uma redução no número de células viáveis para zero após 12 minutos de incubação com 400 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, apresentando uma estabilidade de até 28 dias a 4ºC, para a forma encapsulada.O composto bacteriano foi purificado através de etapas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em Sephadex G-100 e cromatografia de fase reversa em Source-RPC. A purificação resultou num fator de 100 vezes com rendimento de 0.3%. A massa molecular do peptídeo foi determinado em cerca de 800 Da por espectrometria de massas. A bacteriocina étermo-resistente, suportando aquecimento a 100ºC por 5 minutos, e estável na faixa de pH de 6 a 10, porém sensível à ação de pronase E, butanol e ácido tricloroacético. O experimento realizado revelou ainda propriedades emulsificantes desta substância. Dados de espectroscopia de infravermelho indicaram uma estrutura molecular semelhante à de lipopeptídeos como, a surfactina e a lichenisina. Em relação à toxicidade frente a hemácias, em testes qualitativos, aferiram-se propriedades atóxicas, o que pode sugerir estudos mais detalhados sobre ensaios toxicológicos para uma provável utilização em produtos alimentícios. / Bacillus licheniformis P40 produces a bacteriocin that presents potential for use as biopreservative in the control of pathogenic and spoilage microorganisms like Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Erwinia carotovora. In that way, these substances present a biotechnological interest that it can be explored by the food industry. This work has as objectives the purification and incorporation of antimicrobial peptide into nanovesicles. The bacteriocin was incorporated in phopholipidic nanovesicles, resulting in particle size of about 570 nm. There was complete inhibition of the growth of L. monocytogenes with the addition of 100 and 50 UA.mL-1 of encapsulated and free bacteriocin, respectively. It was observed a reduction in the number of viable cells to zero after 12 minutes incubation with 400 UA.mL-1 of encapsulated or free bacteriocin, presenting a stability of until 28 days to 4ºC for the encapsulated form.The bacterial composition was purified through steps of precipitation with ammonium sulfate, gel-filtration chromatography in Sephadex G-100 and reverse phase chromatography Source-RPC. The purification factor was 100 fold with yield of 0.3%. The molecular mass of the peptide was determined as about 800 Da by mass spectrometry. The bacteriocin was heat resistant, supporting heating at 100ºC for 5 minutes, was stable at pH from 6 to 10, but sensitive to the action of pronase E, butanol and trichloroaceticacid. Accomplished experiment indicated the peptide has emulsifying properties. Infrared spectroscopy indicated a molecular structure similar to some lipopeptides like surfactin and lichenisin. In relation to the toxicity front erythrocytes, non-toxic properties were observedd, which indicate more detailed studies on toxicological rehearsals for a probable use in food products.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-18T13:55:46Z No. of bitstreams: 1 2013_MarianaMagalhãesNóbrega_Parcial.pdf: 4669193 bytes, checksum: 470b6e88d4408bfc14b01984e61c33ac (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-24T13:51:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarianaMagalhãesNóbrega_Parcial.pdf: 4669193 bytes, checksum: 470b6e88d4408bfc14b01984e61c33ac (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-24T13:51:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarianaMagalhãesNóbrega_Parcial.pdf: 4669193 bytes, checksum: 470b6e88d4408bfc14b01984e61c33ac (MD5) / A prospecção de peptídeos com atividade biológica é importante do ponto de vista biotecnológico assim como ponto de partida em diversos ramos da pesquisa como no desenvolvimento de novas drogas e na produção de plantas geneticamente modificadas. Este trabalho tem como objetivo a predição e a síntese de peptídeos que tenha atividade antinociceptiva e hipotensora. A predição da estrutura primária dos peptídeos foi realizada com base em trabalhos anteriores do grupo, os quais focam na prospecção e caracterização de peptídeos bioativos, assim como no conhecimento disponível na literatura acerca das propriedades biológicas apresentadas por domínios protéicos específicos. Os peptídeos foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, utilizando a estratégia Fmoc, seguida da purificação em cromatografia líquida de alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação da estrutura primária dos peptídeos sintetizados foram determinados por espectrometria de massa, Maldi e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos , por via intraperitoneal com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva, realizaram-se então os testes da placa quente ou Hot Plate e teste de retirada da cauda ou Tail Flick. Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva via receptores opióides com perfil de atividade mais tardio e duradouro em relação a morfina. Eles apresentaram atividade nos dois modelos de testes propostos, podem ter atravessado a barreira hematoencefálica e possuem ação prolongada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / To prospect of peptides with biological activity is important from the point of view of biotechnology as a starting point in many fields of research as the development of new drugs and the production of genetically modified plants. This study aims to predict and synthesize peptides that have antinociceptive and hypotensive activities. The prediction of the primary structure of the peptides was based on previous work of the group, which focuses on the prospection and characterization of bioactive peptidesas well as in the knowledge available in the literature about the biological properties of specific protein domains. The peptides were synthesized by solid-phase chemical synthesis using Fmoc strategy followed by purification on high performance liquid chromatography. The purity and confirmation of the primary structure of the synthesized peptides were determined by mass spectrometry, MALDI and ESI.The peptides were injected in mice intraperitoneally in order to assess its possible antinociceptive activity through Hot Plate and Tail Flick assays.The in vivo tests showed that synthetic peptides PSLEM 11011 and 11012 have antinociceptive activity via opioid receptors with delayed response and longer activity compared to morphine. The peptides showed activity in both test models proposed in this work, may have crossed the blood-brain barrier and presenting high bioavailability.

Bacillus licheniformis P40 produz uma bacteriocina que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos entre os quais se destacam Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Erwinia carotovora. Estas substâncias possuem grande potencial biotecnológico que pode ser explorado pela indústria alimentícia. Assim sendo, este trabalho teve como objetivos a purificação e incorporação do peptídeo antimicrobiano em nanovesículas. A bacteriocina foi incorporada em nanovesículas de fosfatidilcolina, resultando em partículas de cerca de 570 nm. Houve Inibição completa do crescimento de L. monocytogenes com a adição de 100 e 50 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, respectivamente. Observou-se uma redução no número de células viáveis para zero após 12 minutos de incubação com 400 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, apresentando uma estabilidade de até 28 dias a 4ºC, para a forma encapsulada.O composto bacteriano foi purificado através de etapas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em Sephadex G-100 e cromatografia de fase reversa em Source-RPC. A purificação resultou num fator de 100 vezes com rendimento de 0.3%. A massa molecular do peptídeo foi determinado em cerca de 800 Da por espectrometria de massas. A bacteriocina étermo-resistente, suportando aquecimento a 100ºC por 5 minutos, e estável na faixa de pH de 6 a 10, porém sensível à ação de pronase E, butanol e ácido tricloroacético. O experimento realizado revelou ainda propriedades emulsificantes desta substância. Dados de espectroscopia de infravermelho indicaram uma estrutura molecular semelhante à de lipopeptídeos como, a surfactina e a lichenisina. Em relação à toxicidade frente a hemácias, em testes qualitativos, aferiram-se propriedades atóxicas, o que pode sugerir estudos mais detalhados sobre ensaios toxicológicos para uma provável utilização em produtos alimentícios. / Bacillus licheniformis P40 produces a bacteriocin that presents potential for use as biopreservative in the control of pathogenic and spoilage microorganisms like Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Erwinia carotovora. In that way, these substances present a biotechnological interest that it can be explored by the food industry. This work has as objectives the purification and incorporation of antimicrobial peptide into nanovesicles. The bacteriocin was incorporated in phopholipidic nanovesicles, resulting in particle size of about 570 nm. There was complete inhibition of the growth of L. monocytogenes with the addition of 100 and 50 UA.mL-1 of encapsulated and free bacteriocin, respectively. It was observed a reduction in the number of viable cells to zero after 12 minutes incubation with 400 UA.mL-1 of encapsulated or free bacteriocin, presenting a stability of until 28 days to 4ºC for the encapsulated form.The bacterial composition was purified through steps of precipitation with ammonium sulfate, gel-filtration chromatography in Sephadex G-100 and reverse phase chromatography Source-RPC. The purification factor was 100 fold with yield of 0.3%. The molecular mass of the peptide was determined as about 800 Da by mass spectrometry. The bacteriocin was heat resistant, supporting heating at 100ºC for 5 minutes, was stable at pH from 6 to 10, but sensitive to the action of pronase E, butanol and trichloroaceticacid. Accomplished experiment indicated the peptide has emulsifying properties. Infrared spectroscopy indicated a molecular structure similar to some lipopeptides like surfactin and lichenisin. In relation to the toxicity front erythrocytes, non-toxic properties were observedd, which indicate more detailed studies on toxicological rehearsals for a probable use in food products.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000348257-Texto+Completo-0.pdf: 502199 bytes, checksum: 153dec6d7d64e7e505527b64b42f0540 (MD5) Previous issue date: 2006 / The gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) has been implicated in central nervous system diseases, including neurodevelopmental disorders associated with autism. In the present study we examined the effects of GRPR blockade during the neonatal period on behavioral measures relevant to animal models of neurodevelopmental disorders. Male Wistar rats were given an intraperitoneal (i. p. ) injection of either saline (SAL) or the GRPR antagonist [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesin (6-14) (RC-3095; 1 or 10 mg/kg) twice daily for 10 days from postnatal days (PN) 1 to 10. Animals treated with RC-3095 showed pronounced deficits in social interaction when tested at PN 30-35 and impaired 24-h retention of memory for both novel object recognition (NOR) and inhibitory avoidance tasks tested at PN 60-71. Neither short-term memory tested 1. 5 h posttraining nor open field behavior were affected by neonatal GRPR blockade. The implications of the findings for animal models of neurodevelopmental disorders are discussed. / O receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) vem sendo relacionado a doenças do sistema nervoso central, incluindo desordens do desenvolvimento neurológico associadas ao autismo. No presente estudo, analisamos os efeitos do bloqueio do GRPR durante o período neonatal em medidas comportamentais relevantes em modelos animais de desordens do desenvolvimento neurológico. Ratos Wistar machos receberam injeções intraperitoneais (i. p) de salina (SAL) ou do antagonista do GRPR [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesina (6-14) (RC-3095; 1 ou 10 mg/kg) duas vezes ao dia, do primeiro ao décimo dias de vida. Os animais tratados com RC-3095 demonstraram déficits pronunciados em interação social quando testados no período de 30-35 dias de idade. Prejuízos na retenção da memória 24h após o treino em ambas as tarefas; de reconhecimento do objeto novo (RON) e de esquiva inibitória, foram demonstrados quando os animais foram testados aos 60-71 dias de idade. O bloqueio neonatal do GRPR não afetou o comportamento em teste de memória de curta duração, 1,5h após o treino, tampouco o comportamento em campo aberto. As implicações desses achados em modelos animais de desordens do desenvolvimento neurológico são discutidas.

Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico. / Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound.

Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico. / Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound.

Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico. / Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound.

Made available in DSpace on 2015-05-29T12:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000469525-Texto+Completo-0.pdf: 2925199 bytes, checksum: d0ce1f2f0c3cdc1d309d3f09e9a7d239 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introduction : Preeclampsia is a disease characterized as high maternal and fetal morbidity and mortality, diagnosed only after 20th gestational week, its etiology is not completely understood and healing is placental removal. It has been looking for biomarkers that allow early diagnosis for a better outcome of the disease. The 90 kDa isoform of Angiotensin Converting Enzyme (ACE), proposed as a new biomarker for hypertension, has not been studied in the preeclampsia syndrome so far.Objective : To evaluate the gene and protein expression, as well as enzymatic activity of ACE in pregnancy induced hypertension.Material and methods : It were included 69 normotensive and preeclampsia syndrome pregnant women at São Lucas Hospital/PUCRS, Porto Alegre/ RS- Brazil. Blood sample was collected to perform ACE genetic polymorphism, and three urine samples (during pregnancy, after delivery and at least 3 months after delivery) were taken to perform ACE protein polymorphism and enzymatic activity. This study was conducted through a partnership between Nephrology Service from PUCRS and Kidneys and Hormones from UNIFESP Laboratories research.Results : Scientific paper was published in Medical Hypotheses journal, entitled “Angiotensin Converting Enzyme 90 kDa isoform: Biomarker for diagnosis of preeclampsia?” that described the hypotheses of this research. Comparing the participants clinical data among the groups (Normal pregnant, pure preeclampsia, superimposed preeclampsia), statistical significancy was observed between obstetric gestational age, blood pressure, newborn weight (p< 0. 001) and placental weight (p= 0. 030). Hypertension familial history compared with ACE genotypes (p= 0. 017) suggests allele I involvement. Enzymatic activity ZPhe and Hhl ratio was different during the gestational period (p< 0. 025), and also in relation to the ACE genotypes (p< 0. 001). ZPhe and HhL isolated enzymatic activity also, in relation to the ACE genotypes, was not statistically different (p = 0. 83 e p = 0. 16, respectively). The protein polymorphism was not performed due to some technique problems, but this activity will be finished as soon as possible.Conclusion : It seems that allele I is associated with the hypertension familial history, and the genotypes that have this allele (ID, II) are predominantly present in pregnant women with preeclampsia. Enzymatic activity of Zphe/Hhl shows different behavior during the gestational period, and it also change according to genotypes classification. The data suggest that the mechanism involved in essential hypertension can be different from those involved in transient and spontaneous hypertension triggered pregnancy induced hypertension. / Introdução : Pré-eclâmpsia é uma doença de alta morbimortalidade materna e fetal, diagnosticada somente após a 20º semana gestacional, de etiologia não totalmente esclarecida e a cura consiste na retirada da placenta. Segue-se na busca de biomarcadores que possibilitem um diagnóstico precoce para um melhor desfecho da doença. A isoforma 90 kDa da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), proposta como novo marcador de hipertensão, ainda não foi estudada na síndrome de pré-eclâmpsia.Objetivos : Avaliar a expressão genética, proteica e enzimática da ECA na Doença Hipertensiva Gestacional.Materiais e métodos : Foram incluídas 69 gestantes normotensas e com Síndrome de Pré-eclâmpsia (Pré-eclâmpsia Pura ou Sobreposta) no Hospital São Lucas da PUCRS, Porto Alegre/ RS- Brasil. Foram coletadas uma amostra de sangue para realizar o polimorfismo genético da ECA e 3 amostras de urina (durante a gestação, após o parto e pelo 3 meses após o parto) para realizar a análise do polimorfismo proteico e a atividade enzimática da ECA. Este estudo teve parceria entre os laboratórios de pesquisa de Nefrologia da PUCRS e Rins e Hormônios da UNIFESP.Resultados : Foi publicado um artigo científico na revista Medical Hypotheses, intitulado em Angiotensin Converting Enzyme 90 kDa isoform: Biomarker for diagnosis of preeclampsia?, descrevendo a hipótese desta pesquisa. Comparando os dados clínicos das participantes entre os grupos analisados (Gestante normal, Pré- eclâmpsia Pura e Pré- eclampsia Sobreposta), houve significância estatística entre idade gestacional obstétrica, níveis pressóricos, peso do recém-nascido (p<0,001) e peso da placenta (p= 0,030). A história familiar de hipertensão comparada com os genótipos da ECA (p= 0,017) sugere envolvimento do alelo I. A razão da atividade enzimática de Zphe e Hhl foi diferente durante o período gestacional (p<0,025) e também em relação aos genótipos da ECA (p<0,001). Enquanto que a atividade enzimática isolada de Zphe e Hhl em relação aos genótipos da ECA não foi significativa (p = 0,83 e p = 0,16, respectivamente). A análise do polimorfismo proteico não foi realizada devido a problemas na execução da técnica, mas essa atividade será concluída assim que possível.Conclusão : O alelo I parece estar associado com a história familiar de hipertensão e os genótipos que possuem esse alelo (ID, II) estão predominantemente mais presentes nas gestantes que apresentam pré-eclâmpsia. A atividade enzimática de ZPhe/Hhl apresenta comportamento diferente durante o período gestacional e também se altera conforme a classificação genotípica da gestante. Os dados sugerem que os mecanismos envolvidos na hipertensão essencial possam ser diferentes dos envolvidos na hipertensão transitória e espontânea desencadeada nas Doenças Hipertensivas Gestacionais.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-20T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) Previous issue date: 2017-10-24 / A caracterização de peptídeos encriptados em proteínas pode ser uma estratégia que possibilita diversas aplicações na biotecnologia, que vão desde o desenvolvimento de novos fármacos até a produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo tem como objetivo geral a prospecção, bem como, o desenho de novas moléculas a partir de peptídeos encriptados em proteínas que possam apresentar atividades biológicas. Dessa forma, foram desenhados dois peptídeos que apresentam dupla atividade (opioide e hipotensora). Tais peptídeos foram sintetizados isoladamente e também de maneira que formassem uma única cadeia polipeptídica, dando origem a uma pequena proteínas de 35 resíduos contendo duas pontes dissulfeto denominada MTOXI. O objetivo do desenho da MTOXI é a otimização da atividade frente à ação de proteases, permitindo uma liberação possivelmente controlada de peptídeos. Tanto os peptídeos separadamente, quanto a proteína MTOXI foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, seguida da purificação em cromatografia líquida em alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação foram determinados por espectrometria de massa, MALDI e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos por via intraperitoneal, com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva nos testes da placa quente (Hot Plate) e teste de retirada da cauda (Tail Flick). Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva com perfil de atividade mais lento e duradouro em relação à morfina. A proteína MTOXI foi digerida com tripsina, em quadruplicatas, sendo avaliado o perfil de proteólise e liberação dos fragmentos peptídicos durante uma hora. O ensaio da digestão foi analisado por LC-MS incluindo os controles positivo (digestão da proteína reduzida) e negativo. A área de cada fragmento no respectivo tempo foi determinada. Os peptídeos bioativos permaneceram íntegros durante o processo de digestão e apresentaram aumento na área ao longo do tempo, o que sugere que a estratégia desenvolvida é promissora para a liberação controlada de peptídeos e para otimização do perfil de atividade. Posteriormente foi iniciada a expressão de peptídeos antimicrobianos encriptados no genoma de Arabidopsis thaliana (planta modelo) para serem reinseridos no genoma da própria planta com o objetivo de diminuir a suscetibilidade da planta contra o fungo Botrytis cinerea. A utilização de peptídeos encriptados para desenhar peptídeos e proteínas com atividade biológica mostrou-se promissora para futuras aplicações biotecnológicas. / The characterization of encrypted peptides from source proteins can be a strategy that enables several biotechnological applications, ranging from the development of new drugs to the production of genetically modified organisms. The following work aimed at prospecting and designing new molecules using peptides encrypted in proteins that may present biological activities. Thus, two peptides with dual activity (opioid and hypotensive) were designed and subsequently inserted into a small protein (MTOXI) with two dissulfide bridges, in order to optimize activity against the action of proteases and allowing a controlled release of the peptides. The peptides and the MTOXI protein were synthesized by chemical solid-phase synthesis using the fmoc strategy, followed by High Performance Liquid Cromatography (HPLC) purification. The purity and sequence confirmation were determined by MALDI and ESI mass spectrometry. The peptides were intraperitoneally injected in mice with the purpose of evaluating the antinociceptive activity via Hot plate and Tail Flick tests. In the in vivo assays, the synthetic peptides PSLEM 11011 and PSLEM 11012 presented antinociceptive activity with a later and long-lasting activity profile compared to morphine. The MTOXI protein was digested with trypsin, in four replicates, and the proteolysis profile and peptide fragment release analyzed during 5, 10, 15, 30, 45 and 60 minutes. The digestion assay was analyzed in each time by LC-MS, including the positive (reduced protein digestion) and negative controls. Determination of the area of each fragment in the respective time was obtained and disulfide pair formation identified. Bioactive peptides remained intact during the digestion process and showed increased area over time, which suggests that the developed strategy for the controlled release of peptides and optimization of activity profile is promising. Later, the identification and selection of peptides with antimicrobial physicochemical properties, encrypted in the genome of Arabidopsis thaliana was conducted. These peptides were reintroduced into A. thaliana´s own genome aiming at reducing plant susceptibility to the pathogen Botrytis cinerea. The use of encrypted peptides to design peptides and proteins with biological activity has shown promise for future biotechnological applications.