Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico. / Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound.

Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico. / Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound.

Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico. / Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound.

Haemophilus parasuis es l'agent etiológic de la malaltia de Glässer's, però aquesta bactèria pot causar altres manifestacions clíniques, a més a més de poder ser aïllat del tracte respiratori superior de porcs sans. Els aïllaments de H. parasuis poden presentar diferents fenotips (per exemple diferent perfil de proteïnes, morfologia de colònia o bé producció de càpsula) i diferent capacitat patogènica. Les diferencies entre soques també s'han demostrat a nivell genètic. S'han emprat varis mètodes de tipat per classificar soques de camp d' H. parasuis, però totes presentaven problemes de resolució o implementació. Per resoldre aquestes limitacions es van avaluar diferents tècniques basades en seqüenciació d'ADN. Conseqüentment l'objectiu d'aquest estudi fou millorar el tipat d' H. parasuis i examinar l'associació entre grups de soques i aparició de malaltia. En el primer capítol d'aquest treball s'estudià l'ús d'una seqüència parcial del gen "heat shock protein 60 KDa" (hsp60) com a marcador epidemiológic en un esquema de "single locus sequence typing" (SLST). Es compararen els resultats obtinguts emprant patrons de "enterobacterial repetitive intergenic consensus" (ERIC)-PCR, seqüències parcials de hsp60 i 16S rARN de 103 soques d' H. parasuis i altres espècies relacionades. En el segon capítol d'aquest treball es va desenvolupar un esquema de "multilocus sequence typing" (MLST) fent servir seqüències parcial del gens "house-keeping" mdh, 6pgd, atpD, g3pd, frdB, infB and rpoB. Onze soques de referència i 120 soques de camp van ser incloses en aquest darrer estudi. Els nostres resultats mostren que la hsp60 es un marcador fiable per estudis epidemiológics d' H. parasuis, i que l'anàlisi d'aquesta seqüència es una aproximació millor que els mètodes basats en patrons de bandes. Sorprenentment els gen 16S rARN mostrà prou variabilitat com per ser emprat en el tipatge de H. parasuis enlloc de només en la identificació a nivell d'espècie. A més a més, l'anàlisi de les seqüències de hsp60 i 16S rARN revelaren l'existència de un llinatge divergent de soques associades a l'aparició de malaltia. Ambdós estudis, un amb SLST i l'altre amb MLST, indicaren l'existència de transferències laterals de gens entre soques de H. parasuis i Actinobacillus invalidant l'ús d'aproximacions basades en un sol gen en l'anàlisi filogenètic d'aquesta espècie. L'anàlisi amb MLST mostrà l'existència de 6 "clusters". Quan s'examina l'origen clínic dels aïllaments es veié que un dels "clusters" estava estadísticament associat amb l'aïllament nasal mentre que un altre era associat amb l'aïllament de lesions. El darrer "cluster" incloïa les mateixes soques que el llinatge associat amb l'aparició de malaltia prèviament descrit amb els gens hsp60 i 16S rARN. Finalment, tot i que H. parasuis presenta una estructura de població lliurement recombinant es van trobar dues branques divergents en construir un arbre "neighbour-joining" amb les seqüències del MLST concatenades. Aquesta troballa dona suport als resultats obtinguts amb el gen 16S rARN indicant que H. parasuis sembla tenir una especiació críptica enlloc de una estructura de població panmíctica. / Haemophilus parasuis is the etiological agent of Glässer's disease, but this bacterium causes other clinical outcomes and can also be isolated from the upper respiratory tract of healthy pigs. Isolates of H. parasuis differ in phenotypic features (e.g. protein profiles, colony morphology or capsule production) and pathogenic capacity. Differences among strains have also been demonstrated at the genetic level. Several typing methods have been used to classify H. parasuis field strains, but they showed resolution or implementation problems. To overcome these limitations, different DNA sequence based techniques were evaluated. Consequently, the final goal of this study was to improve H. parasuis typing and examine the association of groups of strains with disease outcome. In the first chapter of this work, a partial sequence from the heat shock protein 60 KDa (hsp60) gene was assessed as epidemiological marker in a single locus sequence typing (SLST). We compared enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR patterns, partial sequences of hsp60 and 16S rRNA genes from 103 strains of H. parasuis and other related species. In the second chapter of this work, we developed a multilocus sequence typing (MLST) system using partial sequences of the house-keeping genes mdh, 6pgd, atpD, g3pd, frdB, infB and rpoB. Eleven reference strains and 120 field strains were included in this latter study. Our results showed that hsp60 is a reliable marker for epidemiological studies in H. parasuis, and the analysis of its sequence is a better approach than fingerprinting methods. Surprisingly, the 16S rRNA gene showed enough variability to be used, not only for species identification, but also for typing. Furthermore, the analysis of the hsp60 and 16S rRNA sequences revealed the presence of a separated lineage of disease-associated strains. Both SLST and MLST studies indicated the occurrence of lateral gene transfer among H. parasuis and Actinobacillus strains invalidating the use of single gene approaches in the phylogenetic analysis of these species. MLST analysis revealed the existence of 6 clusters. When the clinical background of the isolates was examined, one cluster was statistically associated with nasal isolation, while another cluster was associated with isolation from lesions. The latter cluster was the same disease-associated cluster identified by hsp60 and 16S rRNA gene analysis. Finally, although a freely recombining population structure was reported, two divergent branches were found when a neighbour-joining tree was constructed with the concatenated sequences. The latter, supports the results obtained by 16S rRNA gene sequencing and indicate that H. parasuis is more likely to have a cryptic speciation than a true panmictic population structure.

Haemophilus parasuis é o agente etiológico da Doença de Glässer, que causa artrite, pneumonia, meningite e poliserosite em suínos e tem assumido grande importância na suinocultura moderna, uma vez que sua ocorrência tem aumentado significativamente nos últimos anos em rebanhos afetados pelo circovirus suíno tipo 2. No presente estudo foram avaliadas 117 amostras de H. parasuis isoladas dentre os anos de 2009 a 2014, isoladas de suínos de diferentes estados do da região Centro-Sul do Brasil. As estirpes foram submetidas à sorotipificação, confirmação do gênero/espécie pela PCR, o perfil de resistência a antimicrobianos foi avaliado através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM), foi realizada a caracterização genotípica das amostras por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e por sequenciamento de múltiplos sítios (multilocus sequence typing - MLST) e a presença de genes de virulência vtaA foi analisada. Os sorotipos mais frequentes foram: 4 (21,3%), seguido do 5 (12,9%), do 13 (9,4%), do 14 (7,7%) e do sorotipo 1 (1,7%), e em alguns casos mais de um sorotipo foi identificado na mesma granja e até no mesmo animal, resultado este parecido ao encontrado no restante do mundo. Em todas as amostras o gene vtaA estava presente, para alguns antibióticos os índices de resistência foram elevados, como para tilosina (98,29%), danofloxacina (95,72%), sulfadimetoxina (88,03%), penicilina (77,7%) e a multirrestencia atingiu o índice alarmente de 93,16% das estirpes. Foram identificados 67 perfis diferentes no PFGE e das 9 amostras analisadas pelo MLST foram identificados novos STs, até então, não descritos mundialmente. Quando os novos STs foram comparados com os previamente descritos, estas se dispersaram entre as descritas em diferentes países. Neste estudo foi possível observar que as estirpes de H. parasuis brasileiras possuem alta variabilidade, tanto nos sorotipos, perfis de resistência, análises genômicas de PFGE e MLST / Haemophilus parasuis is the etiological agent of Glässer disease that causes arthritis, pneumonia, meningitis and polyserositis in pigs and has assumed great importance in modern swine production, since its occurrence has increased significantly in recent years in herds affected by porcine circovirus type 2. In the present study 117 strains of H. parasuis isolated between 2009 to 2014 were utilized, isolated from pigs of south center of Brazil. The strains were serotyping, confirmed genus/species by PCR, the antimicrobial resistance profile was evaluated determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and strains were genotypically characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and presence of vtA virulence gene. The major serotypes identified were 4 (21.3%), 5 (12.9%), 13 (9.4%), 14 (7.7%) and at last the 1 (1.7%), In some cases more than one serotype was identified in the same farm and in the same animal, this results were identified in others parts of the world. All samples had vtA gene. The resistance for some antibiotics was high for tylosin (98.29%), danofloxacin (95.72%) sulfadimetoxin (88.03%), and penicillin (77.7%). Multidrug resistance rates reached 93.16% of the samples. A total of 67 different profiles were identified in PFGE and nine samples were analyzed by MLST. All nine strains tested were identified as new STs. When these strains were compared with MLST database, they were dispersed among the strains from other countries. In this study, it was clear that the Brazilian H. parasuis strains are highly variable considering serotypes, resistance profiles, genomic analysis of PFGE and MLST

Haemophilus parasuis é um dos agentes bacterianos que tem assumido grande importância na indústria suinícola nos últimos anos. Por muitos anos foi considerada uma doença esporádica de suínos jovens, no entanto, com o surgimento de doenças imunossupressoras ou com o aumento da criação de suínos com alto status sanitário, sua freqüência vem assumindo proporções cada vez maiores. A caracterização das cepas através de métodos fenotípicos como a sorotipagem não tem sido suficiente para os estudos epidemiológicos sobre esta bactéria, uma vez que muitos isolados não são sorotipificáveis. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os isolados através da sorotipagem, do Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP) e da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE), comparando os resultados obtidos. Dentre as 51 cepas de Haemophilus parasuis avaliadas uma foi classificada como sorotipo 2, doze como sorotipo 4, seis como sorotipo 5, quatro como 13 e sete como sorotipo 14, sendo que vinte e uma amostras não foram sorotipificáveis. Através do AFLP foi possível caracterizar todos os isolados, com um índice discriminatório de 0,98, porém esta técnica não demonstrou uma boa reprodutibilidade. Através da PFGE utilizando a enzima Sma I apenas 14 cepas foram genotipadas, porém com a enzima Not I, todas apresentaram padrões de bandas e o índice discriminatório obtido foi de 0,95. Os perfis obtidos através da PFGE com a enzima Not I apresentaram a melhor correlação com os dados de origem das cepas e seus sorotipos, indicando que a técnica possui um bom potencial para aplicação em estudos epidemiológicos. / In recent years, Haemophilus parasuis has had a growing impact on the swine industry. In the past, Haemophilus parasuis infections were considered to be sporadic in young pigs. However, the incidence is increasing due to immunosuppressive diseases and the increase in the production of pigs with high sanitary status. Characterization of strains using methods based on phenotype identification is not enough to perform epidemiological studies on thebacterium, since a large percentage of isolates are nontypeable). The aim of this study was to characterize isolates according to serotyping, Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), and to compare characterization results. Out of the 51 strains of Haemophilus parasuis evaluated in this study: one was serotype 2; twelve serotype 4; six serotype 5; four serotype 13; and seven serotype 14. Serotyping could not be performed on the remaining 21 samples. All isolates were characterized using AFLP, with a discriminatory index of 0.98, but reproducibility of this technique is not good. Regarding PFGE, 14 strains were genotyped using enzyme Sma I; yet, with enzyme Not I, all strains presented band size and discriminatory index power of 0.95. The profiles obtained using PFGE with Not I presented better correlation with the origin and serotype of the strains, suggesting that this technique could be used in epidemiological studies with promising results.

Haemophilus parasuis é o agente etiológico da Doença de Glässer, que causa artrite, pneumonia, meningite e poliserosite em suínos e tem assumido grande importância na suinocultura moderna, uma vez que sua ocorrência tem aumentado significativamente nos últimos anos em rebanhos afetados pelo circovirus suíno tipo 2. No presente estudo foram avaliadas 117 amostras de H. parasuis isoladas dentre os anos de 2009 a 2014, isoladas de suínos de diferentes estados do da região Centro-Sul do Brasil. As estirpes foram submetidas à sorotipificação, confirmação do gênero/espécie pela PCR, o perfil de resistência a antimicrobianos foi avaliado através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM), foi realizada a caracterização genotípica das amostras por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e por sequenciamento de múltiplos sítios (multilocus sequence typing - MLST) e a presença de genes de virulência vtaA foi analisada. Os sorotipos mais frequentes foram: 4 (21,3%), seguido do 5 (12,9%), do 13 (9,4%), do 14 (7,7%) e do sorotipo 1 (1,7%), e em alguns casos mais de um sorotipo foi identificado na mesma granja e até no mesmo animal, resultado este parecido ao encontrado no restante do mundo. Em todas as amostras o gene vtaA estava presente, para alguns antibióticos os índices de resistência foram elevados, como para tilosina (98,29%), danofloxacina (95,72%), sulfadimetoxina (88,03%), penicilina (77,7%) e a multirrestencia atingiu o índice alarmente de 93,16% das estirpes. Foram identificados 67 perfis diferentes no PFGE e das 9 amostras analisadas pelo MLST foram identificados novos STs, até então, não descritos mundialmente. Quando os novos STs foram comparados com os previamente descritos, estas se dispersaram entre as descritas em diferentes países. Neste estudo foi possível observar que as estirpes de H. parasuis brasileiras possuem alta variabilidade, tanto nos sorotipos, perfis de resistência, análises genômicas de PFGE e MLST / Haemophilus parasuis is the etiological agent of Glässer disease that causes arthritis, pneumonia, meningitis and polyserositis in pigs and has assumed great importance in modern swine production, since its occurrence has increased significantly in recent years in herds affected by porcine circovirus type 2. In the present study 117 strains of H. parasuis isolated between 2009 to 2014 were utilized, isolated from pigs of south center of Brazil. The strains were serotyping, confirmed genus/species by PCR, the antimicrobial resistance profile was evaluated determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and strains were genotypically characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and presence of vtA virulence gene. The major serotypes identified were 4 (21.3%), 5 (12.9%), 13 (9.4%), 14 (7.7%) and at last the 1 (1.7%), In some cases more than one serotype was identified in the same farm and in the same animal, this results were identified in others parts of the world. All samples had vtA gene. The resistance for some antibiotics was high for tylosin (98.29%), danofloxacin (95.72%) sulfadimetoxin (88.03%), and penicillin (77.7%). Multidrug resistance rates reached 93.16% of the samples. A total of 67 different profiles were identified in PFGE and nine samples were analyzed by MLST. All nine strains tested were identified as new STs. When these strains were compared with MLST database, they were dispersed among the strains from other countries. In this study, it was clear that the Brazilian H. parasuis strains are highly variable considering serotypes, resistance profiles, genomic analysis of PFGE and MLST

Haemophilus parasuis é um dos agentes bacterianos que tem assumido grande importância na indústria suinícola nos últimos anos. Por muitos anos foi considerada uma doença esporádica de suínos jovens, no entanto, com o surgimento de doenças imunossupressoras ou com o aumento da criação de suínos com alto status sanitário, sua freqüência vem assumindo proporções cada vez maiores. A caracterização das cepas através de métodos fenotípicos como a sorotipagem não tem sido suficiente para os estudos epidemiológicos sobre esta bactéria, uma vez que muitos isolados não são sorotipificáveis. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os isolados através da sorotipagem, do Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP) e da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE), comparando os resultados obtidos. Dentre as 51 cepas de Haemophilus parasuis avaliadas uma foi classificada como sorotipo 2, doze como sorotipo 4, seis como sorotipo 5, quatro como 13 e sete como sorotipo 14, sendo que vinte e uma amostras não foram sorotipificáveis. Através do AFLP foi possível caracterizar todos os isolados, com um índice discriminatório de 0,98, porém esta técnica não demonstrou uma boa reprodutibilidade. Através da PFGE utilizando a enzima Sma I apenas 14 cepas foram genotipadas, porém com a enzima Not I, todas apresentaram padrões de bandas e o índice discriminatório obtido foi de 0,95. Os perfis obtidos através da PFGE com a enzima Not I apresentaram a melhor correlação com os dados de origem das cepas e seus sorotipos, indicando que a técnica possui um bom potencial para aplicação em estudos epidemiológicos. / In recent years, Haemophilus parasuis has had a growing impact on the swine industry. In the past, Haemophilus parasuis infections were considered to be sporadic in young pigs. However, the incidence is increasing due to immunosuppressive diseases and the increase in the production of pigs with high sanitary status. Characterization of strains using methods based on phenotype identification is not enough to perform epidemiological studies on thebacterium, since a large percentage of isolates are nontypeable). The aim of this study was to characterize isolates according to serotyping, Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), and to compare characterization results. Out of the 51 strains of Haemophilus parasuis evaluated in this study: one was serotype 2; twelve serotype 4; six serotype 5; four serotype 13; and seven serotype 14. Serotyping could not be performed on the remaining 21 samples. All isolates were characterized using AFLP, with a discriminatory index of 0.98, but reproducibility of this technique is not good. Regarding PFGE, 14 strains were genotyped using enzyme Sma I; yet, with enzyme Not I, all strains presented band size and discriminatory index power of 0.95. The profiles obtained using PFGE with Not I presented better correlation with the origin and serotype of the strains, suggesting that this technique could be used in epidemiological studies with promising results.

Haemophilus parasuis es un miembro de la familia Pasteurellaceae y un importante patógeno del tracto respiratorio porcino, causante de la enfermedad de Glässer. En la actualidad, esta enfermedad es una de las que tiene mayor incidencia en el sector porcino con una elevada repercusión económica. Por este motivo, es necesario estudiar la biología molecular de este patógeno para poder desarrollar vacunas más eficientes que las existentes hasta el presente. Para abordar dicho estudio es imprescindible disponer de algún proceso de transferencia genética eficaz en H. parasuis. No obstante, dado el desconocimiento que se tenía de dicho patógeno, no se conocía ningún mecanismo natural o de laboratorio que permitiera introducir DNA en H. parasuis. Por ello, el primer objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar un método de transferencia genética en H. parasuis que permita estudiar posteriormente los genes implicados en su virulencia y en la colonización del hospedador.En la presente tesis se ha demostrado por vez primera que H. parasuis es capaz de transformar de forma natural si el DNA exógeno contiene la secuencia ACCGAACTC, la cual es muy similar al motivo ACCGCACTT descrito en H. influenzae como Uptake Signal Sequence. Además, se ha optimizado este proceso, determinando las concentraciones más adecuadas de células bacterianas, AMPc y DNA transformante, así como el tiempo de incubación. Un segundo objetivo de este trabajo ha sido averiguar el papel de la timidilato sintasa, enzima clave en la síntesis de desoxitimidina monofosfato (dTMP), en la virulencia de H. parasuis. Para ello, se ha construido un mutante knockout en el gen thyA de H. parasuis y se ha determinado la capacidad de colonización y la inmunogeniciad de la cepa salvaje y de dicho mutante thyA en un modelo animal de cobayas. Los resultados han mostrado que la cepa defectiva en la enzima timidilato sintasa tienen una menor capacidad de colonización, a pesar de que es capaz de inducir una respuesta inmune en el animal. Por ello, el mutante thyA de H. parasuis puede ser un buen candidato para el desarrollo de futuras vacunas.Finalmente, en este trabajo se ha estudiado la importancia de la proteína Fur en la virulencia de H. parasuis. Dicha proteína es un regulador pleiotrópico que, entre otras funciones, controla los mecanismos implicados en la captación de hierro. Para abordar esta parte del trabajo se propuso la construcción de un mutante de H. parasuis defectivo en la proteína Fur. Los resultados obtenidos han mostrado claramente que dicha proteína es esencial para la viabilidad de esta bacteria. Así, se ha determinado el entorno genético del gen fur y se ha confirmado la no viabilidad de los mutantes fur mediante la obtención de cepas merodiploides. / Haemophilus parasuis, is a member of the family Pasteurellaceae and an important respiratory-tract pathogen of swine, which is the etiological agent of Glässer's disease. At present, the H. parasuis infections produce significant mortality and morbidity in pig farms, giving rise to important economic losses in this industry. For this reason, it is necessary to study the molecular biology of this pathogen to develop vaccines more efficient. Because no genetic manipulation system is available for H. parasuis so far, the first objective of this work was to develop a method of gene transfer to study the genes involved in virulence of this organism. In this work has been demonstrated for the first time that H. parasuis is capable of transforming exogenous DNA which contains ACCGAACTC sequence. This sequence is very similar to the motive ACCGCACTT described in H. influenzae as Uptake Signal Sequence. In addition, this process has been optimized, determining the most appropriate concentrations of bacterial cells, cAMP and transforming DNA, as well as the incubation time.A second objective of this study was to determine the role of thymidylate synthase enzyme in the virulence of H. parasuis. This enzyme is essential for dTMP synthesis and, consequently, for DNA replication. To do so, a H. parasuis thyA mutant was constructed in order to analyze its colonization characteristics and its capacity to generate serum bactericidal activity in infected guinea pigs. The data showed that colonization by the H. parasuis thyA mutant was much less than that of the wild-type strain. Nevertheless, the mutant generated a strong immunogenic response similar to the wild-type strain. Therefore, the H. parasuis thyA mutant can be a good candidate to develop future vaccines. Finally, this work has studied the importance of the Fur protein in the virulence of H. parasuis. This protein is a global regulator which, among other duties, controls the mechanisms involved in iron uptake. To perform this part of the study was proposed the construction of a H. parasuis fur mutant. The results have clearly shown that this protein is essential for the viability of this bacterium. Thus, it has been determined the genetic surrounding of fur gene and has confirmed the non-viability of fur mutants by obtaining H. parasuis fur-defective merodiploid strains.

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