Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-02-21T19:05:15Z No. of bitstreams: 1 2010_VictorEdgardTavaresSousa.pdf: 6750254 bytes, checksum: 6a576895b0bd5e79d81112167f62aa00 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-18T23:59:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_VictorEdgardTavaresSousa.pdf: 6750254 bytes, checksum: 6a576895b0bd5e79d81112167f62aa00 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-18T23:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_VictorEdgardTavaresSousa.pdf: 6750254 bytes, checksum: 6a576895b0bd5e79d81112167f62aa00 (MD5) / As imunoglobulinas são moléculas complexas de interesse biofarmacêutico que têm sido geralmente produzidas em células animais. Biorreatores alternativos, tais como leveduras também foram considerados, mas sua utilização é dificultada pelo dobramento ineficiente dos anticorpos e adição de cadeias de carboidratos. O objetivo deste trabalho foi produzir um vetor de expressão otimizado para produção de anticorpos completos e seus fragmentos bivalentes F(ab’)2 na levedura Pichia pastoris. Desenvolvemos um vetor de expressão de anticorpos em cadeia única que utiliza uma seqüência reconhecida pela protease KEX para o processamento das cadeias do anticorpo. Usamos este vetor de expressão para inserir um fragmento gênico de uma cadeia variável humanizada anti-CD3, desenhada de forma a otimizar o uso de códons e seu conteúdo GC. Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na levedura metilotrófica Pichia pastoris, linhagem GS115, e cultivado em meio BMMY. A melhor indução foi obtida com metanol 2%. O fragmento de anticorpo mantém sua capacidade de reconhecimento ao antígeno recombinante CD3 produzido em E. coli. Análises por SDS-PAGE e Western Blot indicam degradação das construções recombinantes de anticorpos completos. Para verificar atividade biológica das imunoglobulinas recombinantes, também desenvolvemos um peptídeo recombinante CD3 de cadeia única, contendo cadeias gama e epsilon do antígeno CD3. O antígeno foi expresso na forma de corpúsculo de inclusão em Escherichia coli BL21 pLysE. A associação do antígeno-anticorpo foi verificada por meio de ELISA. Portanto, foi descrito um vetor de expressão em P. pastoris eficiente para a expressão de fragmentos F(ab’)2 com capacidade de ligação ao antígeno CD3. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antibody is a complex biopharmaceutical that has been usually produced in animal cell. Alternative bioreactors such as yeasts have also been considered, but its use is hampered by the inefficient antibody folding and carbohydrate addition. The aim of this work is to produce an optimized expression vector for complete antibodies and its divalent Fab antibody fragment production. We developed a single-chain F(ab’)2 expression vector that codes for a KEX cleavage site, used to process antibody's chains. We used this expression vector to insert a humanized anti-CD3 variable region gene fragment, optimally designed for codon usage and GC content. The resulting plasmid was introduced in the methylotrophic yeast Pichia pastoris strain GS115 and it was grown in BMMY media. Improved induction was achieved using 2% methanol. The antibody fragment appears to maintain its affinity to the antigen site CD3. This suggests that it harbors correctly processed heavy and light chains. SDS-PAGE and Western Blot analyses showed a degradation of the antibody complete form when compared to its fragment F(ab’)2. To check F(ab’)2 biological activity, we also developed a recombinant CD3 peptide, containing gamma and epsilon chain of CD3 antigen produced as a single chain molecule. The antigen was expressed as inclusion bodies in E. coli BL21 pLysE. The antibody-antigen association was observed by ELISA. Therefore, we had described an efficient F(ab`)2 expression vector for P. pastoris, successfully used for the production of a biologically active anti-CD3 antibody F(ab`)2.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Débora Amorim Romcy Pereira (deboraromcy@bce.unb.br) on 2011-06-21T14:46:30Z No. of bitstreams: 1 2010_PauloHenriqueDeFrancoAlcantara.pdf: 1343956 bytes, checksum: b896748355ffd9fb18333e0a2c3b538f (MD5) / Approved for entry into archive by Eveline Gonçalves(eveline@bce.unb.br) on 2011-06-21T15:07:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_PauloHenriqueDeFrancoAlcantara.pdf: 1343956 bytes, checksum: b896748355ffd9fb18333e0a2c3b538f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-21T15:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_PauloHenriqueDeFrancoAlcantara.pdf: 1343956 bytes, checksum: b896748355ffd9fb18333e0a2c3b538f (MD5) / Nos últimos anos o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília tem humanizado anticorpos de interesse clínico visando a sua aplicação terapêutica. A produção de proteínas terapêuticas como essas é de grande interesse para a indústria biofarmacêutica. Com intuito de produzir glicoproteínas estáveis, têm-se utilizado células de mamíferos como sistema de expressão heteróloga, pois estas possuem uma maquinaria pós-transcricional necessária para estabilizar biomoléculas complexas. No entanto, a produção de tais moléculas é geralmente dificultada pela imprevisibilidade e instabilidade da expressão ao longo do tempo. Isso se deve à alta probabilidade de silenciamento dos transgenes ao serem integrados na cromatina das células de mamíferos. Uma das alternativas para contornar esse problema é o melhoramento de vetores de expressão com o emprego de pequenos elementos de DNA (menores que 2100 pares de bases) que atuam como anti-repressores. No presente trabalho foram isolados quatro elementos de DNA humanos semelhantes às sequências dos elementos anti-repressores 35 e 40 identificados por Kwaks e colaboradores em 2003. Um elemento semelhante ao anti-repressor 35 e outro semelhante ao anti-repressor 40 foram clonados no vetor de expressão em células de mamíferos pMIRES anti-CD3 FvFc humanizado (Silva et al., 2009). O elemento anti-repressor 35 apresentou vários alinhamentos no cromossomo 7 humano. Já o elemento 40 pôde ser alinhado com diversas regiões de vários cromossomos, destacando-se os alinhamentos nos cromossomos 14 e 22. Esses elementos de DNA são sequências repetitivas presentes ao longo do genoma humano. Além disso, substituiu-se o promotor de citomegalovírus (CMV) deste mesmo vetor por um promotor CMV otimizado contendo a sequência do intron A (IA). As novas construções de vetores foram transfectadas em células de ovário de hamster chinês (CHO) e clones estáveis foram isolados para posterior caracterização da produção de anticorpos. Devido a sua similaridade com sequências anti-repressoras e o seu predomínio em regiões subcentroméricas, sugere-se que os elementos de DNA isolados sejam importantes na modulação da cromatina exercendo atividade anti-repressora. Outra hipótese é que, devido ao fato de serem elementos repetitivos no genoma humano, tais elementos podem ter sua origem em regiões altamente transcritas de retrotransposons. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recently, the Molecular Immunology group of Universidade de Brasília has humanized clinical antibodies aiming their therapeutic applications. These therapeutic proteins production is of great interest to the biopharmaceutical industry. In order to produce stable glycoproteins, mammalian cells have been used as heterologous expression system since they possess post-translational machinery to stabilize those complex biomolecules. However, the production of such molecules is often hampered down by the unpredictability and instability of expression over time. This is due to the high probability of silencing of transgenes integrated into the chromatin of mammalian cells. One way to overcome this problem is the use of small elements of DNA (less than 2100 base pairs) that act as anti-repressors. In this work we have isolated four DNA human elements similar to the anti-repressors 35 and 40 sequences identified by Kwaks and collaborators in 2003. An element similar to the anti-repressor 35 and other similar to the anti-repressor 40 were cloned into the expression vector for mammalian cells pMIRES humanized anti-CD3 FvFc (Silva et al., 2009). The anti-repressor element 35 presented several alignments on human chromosome 7. Moreover, the element 40 was aligned with different regions on several chromosomes, particularly on chromosomes 14 and 22. These DNA elements are repetitive sequences present throughout the human genome. Additionally, we substituted the vector cytomagalovirus (CMV) promoter by the optimized CMV promoter containing the intron A (IA) sequence. These new vectors constructions were transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO) and stable clones were isolated to acccess the antibody production. Due to its similarity to anti-repressor sequences and its prevalence in sub centromeric regions, it is suggested that the isolated DNA elements are important in the chromatin modulation by exerting anti-repressor activity. Another hypothesis is that, due to the fact that they are repetitive elements in the human genome, these elements may have their origin in retrotransposon’s highly transcribed regions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Química, 2011. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-04-24T15:48:21Z No. of bitstreams: 1 2011_LeandroAndradeMoreira.pdf: 8210868 bytes, checksum: 61a0ec79a5b533c7f9d3c4a970f0ce06 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-04-27T14:00:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LeandroAndradeMoreira.pdf: 8210868 bytes, checksum: 61a0ec79a5b533c7f9d3c4a970f0ce06 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-27T14:00:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LeandroAndradeMoreira.pdf: 8210868 bytes, checksum: 61a0ec79a5b533c7f9d3c4a970f0ce06 (MD5) / A potencialidade do Cerrado Brasileiro (Savana), como fonte de substâncias interessantes sob o ponto de vista químico e farmacológico, tem estimulado uma série de pesquisas visando à descoberta de novas entidades químicas e o desenvolvimento de fármacos. A quantidade do alcalóide indólico bufotenina em sementes de espécies de Anadenanthera vem despertando especial atenção quanto ao seu potencial como matéria-prima para preparação de derivados triptamínicos capazes de agir sobre sistema nervoso central, de exibir propriedade antimicrobiana, antitumoral ou de atuar como capturadores de radicais livres. Neste trabalho, sementes de duas árvores nativas do gênero, A. peregrina (var. peregrina) e A. peregrina (var. falcata), foram coletadas em dois períodos distintos. O alcalóide bufotenina foi isolado das sementes Anadenanthera com elevado padrão de pureza empregando uma adaptação do método de Stromberg. O alcalóide bufotenina foi isolado das sementes com elevado pureza empregando uma adaptação do método de Stromberg. Transformações químicas realizadas na bufotenina forneceram diversos derivados triptamínicos, os quais foram caracterizados por meio de técnicas de CG-EM, IV, RMN 1H e 13C (uni e bidimensionais). A triagem citotóxica realizada em diferentes linhagens de células tumorais humanas HCT-8 (cólon), SF295 (glioblastoma) e MDA-MB435 (melanoma) por meio do método do MTT mostrou que a bufofetina não é citotóxica enquanto que alguns dos seus derivados exibem potente e seletivo efeito antiproliferativo MDA-MB435, merecendo investigação adicional. Esses dados sugerem que modificações químicas na bufotenina podem fornecer substâncias com atividade antitumoral. A bufotenina juntamente com seus derivados estão sob investigação quanto ao perfil antioxidante. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The potentiality of the Brazilian Cerrado (Savannah), as source of interesting substances from the point of view chemical and pharmacological, has stimulated a series of researches aiming the discovery of new chemical entities and the development of drugs. The amount of indole alkaloid bufotenin in seeds of Anadenanthera species has attracted special attention regarding its potential as starting material for the preparation of tryptamine derivatives able to act on central nervous system, to exhibit antimicrobial and antitumoral properties or to work like catchers of free radical. In this work, seeds of two native plant of the genus, A. peregrina (var. peregrina) e A. peregrina (var. falcata), were collected in two distinct periods. The alkaloid bufotenine was isolated from the seeds of Anadenanthera in high purity by using a modification of Stromberg method. Chemical modifications performed on bufotenin furnished several tryptamine derivatives, which were characterizated by GC-EM, FT-IR and RMN 1H and 13C (one and two-dimensional) techniques. The cytotoxicity screening performed in different human cancer cell lines HCT-8 (colon), SF295 (glioblastoma) and MDA-MB435 (melanoma) by the MTT method showed no activity for bufotenin whereas some of its derivatives exhibited potent and selective antiproliferative effect against MDA-MB435, deserving further investigation. These data suggest that chemical modification on bufotenin can provide substances antimural activity. Bufotenin together with its precursors are under investigation concerning the antioxidant profile.

PEREIRA, M. L. Aspectos estruturais, farmacológicos e toxicológicos de Mo-CBP4, uma proteína ligante à quitina de Moringa oleifera com atividade anti-inflamatória e antinociceptiva via oral. 2014. 211 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-22T17:51:51Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_mlpereira.pdf: 5385701 bytes, checksum: bf5a77dbe6d55bd0fb09e766abc43303 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-26T22:44:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_mlpereira.pdf: 5385701 bytes, checksum: bf5a77dbe6d55bd0fb09e766abc43303 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-26T22:44:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_mlpereira.pdf: 5385701 bytes, checksum: bf5a77dbe6d55bd0fb09e766abc43303 (MD5) Previous issue date: 2014 / Mo-CBP4 is a chitin-binding protein that is associated with the antinociceptive and anti-inflammatory effects of Moringa oleifera seeds, a tree known for its medicinal value. The aim of this study was the structural, pharmacological and toxicological characterization of Mo-CBP4, focusing on its use as a therapeutic agent. Mo-CBP4 is a 11.8 kDa heterodimer, composed by 3.9 kDa and 8.4 kDa chains. Mo-CBP4 sequencing by Edman degradation and mass spectrometry showed the presence of many basic amino acid residues and high similarity with other proteins from M. oleifera seeds. Circular dichroism spectroscopy showed that the Mo-CBP4 contains 36% α-helix, 15% β-sheet, 19% turn and 30% unordered and high structural stability to temperature and pH variations. Mo-CBP4 (0.1, 1.0 and 10 mg/kg) by intravenous administration showed anti-inflammatory activity on the model of carrageenan-induced peritonitis in rats, with inhibition (79%) of neutrophil migration already at the lowest dose. Mo-CBP4 (40 mg/kg), when administered by oral route on mice, using the same mentioned model, also presented anti-inflammatory activity, causing a significant inhibition (48%) of neutrophil migration. Mo-CBP4 retained this activity even after heating at 100 °C or pre-incubation with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine, both for 1 hour. Serum levels of IL-1β and IL-10 after peritonitis induction changed in Mo-CBP4-pretreated mice. In addition, Mo-CBP4 (10 mg/kg), administered intraperitoneally, also showed antinociceptive activity by using the formalin (2.5%) test in mice model, inhibiting just the peripheral pain. In the carrageenan-induced mechanical hypernociception model, animals pretreated with oral Mo-CBP4 (20, 40 and 80 mg/kg), 1 hour prior to inflammatory agent use, proved to be more resistant to sensitization after 1, 3 and 5 hours, with maximal inhibition at a dose of 40 mg/kg, being this activity correlated with the reduction of neutrophil migration. Direct hypernociception caused by epinephrine or PGE2 was not affected with Mo-CBP4 pretreatment. Mo-CBP4 did not impair the locomotor activity of animals in the open field test. In general, no toxic signs or adverse effects were seen after oral administration of Mo-CBP4 at a single dose (2000 mg/kg) or after repeated doses (10, 40 and 100 mg/kg). Similarly, cytotoxicity and genotoxicity tests with Mo-CBP4, using tumour or normal cells, showed no toxicity. The results suggest that due to anti-inflammatory and antinociceptive properties, high stability and apparent lack of toxicity, Mo-CBP4 has great potential as a future biopharmaceutical drug. / Mo-CBP4 é uma proteína ligante à quitina, com atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, isolada de sementes de Moringa oleifera Lamarck, uma árvore conhecida pelo seu valor medicinal. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural, farmacológica e toxicológica de Mo-CBP4, com foco na sua utilização como agente terapêutico. Mo-CBP4 é um heterodímero de 11,8 kDa, composto por cadeias de 3,9 kDa e 8,4 kDa. O sequenciamento de Mo-CBP4 por degradação de Edman e espectrometria de massas mostrou a presença de muitos resíduos de aminoácidos básicos e alta similaridade com proteínas isoladas de sementes de M. oleifera. Análises espectroscópicas utilizando dicroísmo circular demonstraram que Mo-CBP4 é composta por α-hélices (36%), folhas-β (15%), voltas (19%) e estruturas ao acaso (30%), com alta estabilidade estrutural frente a variações de temperatura e pH. Mo-CBP4 (0,1, 1,0 e 10 mg/kg), por via endovenosa, mostrou atividade anti-inflamatória no modelo de peritonite induzida por carragenina em ratos, com inibição (79%) da migração de neutrófilos já na menor dose. Atividade anti-inflamatória de Mo-CBP4 (40 mg/kg) também ocorreu por via oral em camundongos, usando o mesmo modelo citado, com significativa inibição (48%) da migração de neutrófilos. Tal atividade permaneceu mesmo após aquecimento da proteína a 100 °C por 1 hora, porém, a pré-incubação com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi capaz de reverter sua ação. Os níveis séricos de IL-1β e IL-10, após indução de peritonite, sofreram alteração com o pré-tratamento da proteína. Adicionalmente, Mo-CBP4 (10 mg/kg) mostrou atividade antinociceptiva, verificada através do teste da formalina (2,5%), quando administrada via intraperitoneal, inibindo apenas a dor periférica. No modelo de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, animais tratados via oral com a proteína (20, 40 e 80 mg/kg), 1 hora antes do agente inflamatório, mostraram-se mais resistentes à sensibilização após 1, 3 e 5 horas, apresentando inibição máxima na dose de 40 mg/kg, estando essa atividade relacionada com a redução da migração de neutrófilos. A hipernocicepção direta causada por PGE2 ou epinefrina não sofreu alteração com o pré-tratamento de Mo-CBP4. A proteína também não causou comprometimento na atividade locomotora dos animais, quando submetidos ao teste do campo aberto. A administração oral de Mo-CBP4 em dose única (2000 mg/kg) ou em doses repetidas (10, 40 e 100 mg/kg) não resultou em efeitos tóxicos ou adversos. Similarmente, avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade de Mo-CBP4, utilizando células tumorais ou normais, mostrou ausência de toxicidade. Os resultados obtidos sugerem que devido às propriedades anti-inflamatória e antinociceptiva, alta estabilidade e aparente ausência de toxicidade, Mo-CBP4 possui grande potencial como um futuro biofármaco.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-04-08T20:09:40Z No. of bitstreams: 1 2015_LeandroAndradeMoreira_Parcial.pdf: 6982675 bytes, checksum: d56bd63a60664bf7c16d7128208787ee (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-09T13:18:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LeandroAndradeMoreira_Parcial.pdf: 6982675 bytes, checksum: d56bd63a60664bf7c16d7128208787ee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-09T13:18:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LeandroAndradeMoreira_Parcial.pdf: 6982675 bytes, checksum: d56bd63a60664bf7c16d7128208787ee (MD5) / O alcaloide indólicobufotenina (5-hidróxi-N,N-dimetiltriptamina) tem sido encontrado em diversas fontes vegetais e animais e, recentemente, vem despertando grande atenção desde a sua detecção em vários fluídos corporais humanos. Esse trabalho descreve um protocolo eficiente para o isolamento da bufotenina de sementes de espécies de Anadenanthera (A. peregrina eA. colubrina), árvores amplamente distribuídas no cerrado brasileiro, e descreve o uso deste alcaloide como matéria-prima apropriada para síntese de vários derivados indólicos com potencial bioativo. A análise química da fração oleaginosa revelou que a composição principal de ácidos graxos insaturados (ácidos oleico e linoleico) sugere elevado valor nutricional das sementes de Anadenanthera. A conversão da bufotenina nos derivados triptamínicosiodeto de 5-hidróxi-N,N,N-trimetiltriptamina (bufotenidina), N,N-dimetiltriptamina (DMT) e 5-metóxi-N,N-dimetiltriptamina (MDMT) foirealizada através deuma rota sintética simplicada e inovadora. Além disso, foi relatado ummétodofácil paraaconversão da bufotenina em um complexo aminoborano inédito. A partir do complexo bufotenina aminoborano foram sintetizados oito dímeros e um derivado oxindólico inéditos. A caracterização estrutural da bufotenina, dos derivados triptamínicos, e oxindólico bem como dos dímeros bis-indólicos foi realizada por CG-MS, FT-IR, RMN 1H e 13C (uni-dimensionais) e HRESI/MS. A bufotenina, bufotenidina e quatros dímeros indólicos foram avaliados como inibidores da acetilcolinesterase (AChE) pelo método da enzima imobilizada em bioreatores capilares acoplados a espectroscopia de massa (AChE-ICERs/LC-MS). Por meio desse estudo, bufotenidina e três dos dímeros testados apresentaram elevada percentagem de inibição da AChE, com destaque para 1,3-bis-((5-metóxi-3-(2-(N,N-dimetil)etilamino)-1H-indol-1-il)propano que exibiu 92,23% de atividade inibitória, maior que a galantamina (90,81 %). / The indole alkaloid bufotenine (5-hydroxy-N,N-dimethyltryptamine) has been found in several vegetal and animal sources, and recently has been attracted great interest since its detection in humans body fluids. This work describes an effortless and efficient protocol for isolation of bufotenine from seeds of Anadenanthera species (A. peregrina andA.colubrina), widespread trees in the Brazilian cerrado, and proposes the utilization of this alkaloid as suitable starting material for the synthesis of various potential bioactive indole derivatives. The analyses of the oleaginous fractions revealed that the main fatty acid composition (oleic and linoleic) indicates the nutritional value of the Anadenanthera seeds. The conversion of the bufotenine tryptamine derivatives into 5-hydroxy-N,N,N-trimethyltryptamine iodide (bufotenidine), N-dimethyltryptamine N,N-dimethyltryptamine (DMT), 5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine (MDMT) was accomplished through an innovative and short synthetic pathway. Furthermore, it was reported an effortless methodology for conversion of the bufotenine into the inherit amineborane complex. Starting from bufotenine-amineborane complex eight new dimers and an oxindole derivative were synthesized. The structural characterization of bufotenine, tryptamine and oxindole derivatives as well as the bis-indole dimers was accomplished by GC-MS, FT-IR, 1H and 13C NMR (uni and two-dimensional) and HRESI/MS. Thebufotenine, bufotenidine andfour dimerswere evaluatedas inhibitorsof the acetylcholinesterase (AChE)by immobilized capillary enzyme reactor-tandem mass spectroscopy (AChE-ICERs/LC-MS) method. Through this study the tested bufotenidine and three dimers showed great percentage of the AchE inhibition, highlighting for propane-1,3-diylbis(5-methoxy-1H-indole-1,3-diyl))bis(N,N-dimethylethan-1-amine which exhibited 92,23% of inhibitory activity, higher than the galantamine (90,81 %).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-02-07T11:37:05Z No. of bitstreams: 1 2012_HugodeAlmeidaSilva.pdf: 26275960 bytes, checksum: e989f3c1ea7ff8962448ff618330ac1a (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-07T11:57:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_HugodeAlmeidaSilva.pdf: 26275960 bytes, checksum: e989f3c1ea7ff8962448ff618330ac1a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-07T11:57:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_HugodeAlmeidaSilva.pdf: 26275960 bytes, checksum: e989f3c1ea7ff8962448ff618330ac1a (MD5) / Apesar de afetarem praticamente um sexto da população mundial, doenças como a dengue e o mal de Chagas continuam sendo negligenciadas pela indústria farmacêutica e pelo governo. Assumindo a responsabilidade da pesquisa de base, as instituições de ensino superior podem tornar o desenvolvimento de fármacos contra as doenças negligenciadas mais atraentes aos olhos da indústria. Com a proposta de diminuir os gastos e o tempo na busca de novos medicamentos contra essas doenças, o presente trabalho buscou aplicar métodos de análise in silico para a implementação de uma plataforma de descoberta racional de fármacos voltada para as doenças importantes no Brasil. Dessa forma, duas doenças para as quais não existem vacinas ou tratamento efetivo foram escolhidas para um estudo piloto: a dengue e a doença de Chagas. Um dos alvos mais promissores contra a dengue é a protease virai NS3, que, associada ao seu cofator NS2B, promove o processamento da poliproteína virai e, consequentemente, a replicação do vírus. Por meio de técnicas de modelagem comparativa, dinâmicas moleculares e triagem virtual, um possível papel para o cofator NS2B e para o ligante no efeito de ajuste induzido do sítio ativo da NS3 foi proposto. Além disso, quatro famílias de conformações foram encontradas e exploradas em uma campanha de triagem virtual, onde foram obtidos quatro moléculas com atividade inibitória comprovada. Ao mesmo tempo, técnicas similares foram aplicadas a dois alvos de Trypanosoma cruzi já estudados pelo nosso grupo: a catepsina B (TcCatB) e a metiltioadenosina fosforilase (TcMTAP). Os modelos construídos se mostraram estáveis durante simulações de dinâmica molecular, e também foram submetidos à triagem virtual. Moléculas com atividade inibitória putativas contra esses alvos foram identificadas. Os resultados deste trabalho apontam para a viabilidade de estabelecer-se uma plataforma de busca racional de fármacos contra outras doenças negligenciadas. / Despite affecting about one-sixt of the world's population, diseases like dengue fever and Chagas disease are still overlooked by the government and pharmaceutical industries. By assuming the responsibility over basic research, public institutions of higher education may play a role in making the development of new drugs against neglected diseases more attractive to the big pharma companies. With the aim of cutting costs and time for searching new drugs against those diseases, this work intended to apply in silico analysis methods towards the implementation of a rational drug design platform against neglected diseases occurring in Brazil. Thus, two illnesses for which there are no vaccines or effective treatments were chosen for a pilot study: dengue fever and Chagas disease. One of the most promising targets against dengue fever is the viral NS3 protease, which, together with its cofactor NS2B. promotes the viral polyprotein processing and therefore viral replication. By using comparative modeling techniques, molecular dynamics simulations and virtual screening, a possible role of the NS2B cofactor and the ligand binding in the induced fit effect at the NS3 active site was proposed. Also, four conformational families were found and explored in a virtual screening campaign, in which four compounds with proven inhibitory activity were found. At the same time, similar techniques were applied to two targets of Trypanosoma cruzi already studied by our team: the cathepsin B (TcCatB) and the methyltioadenosine phosphorilase (TcMTAP). The built models were shown to be stable during molecular dynamics simulations, and were also subjected to virtual screening campaigns. Molecules with putative inhibitory activity against those targets were detected. Together, those results point to the viability in establishing a rational drug discovery platform against neglected diseases.

Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2011-06-28T17:16:33Z No. of bitstreams: 1 2011_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 2293994 bytes, checksum: e7e90ab7ad78952c1b1ecab8c28f79cc (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-29T16:49:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 2293994 bytes, checksum: e7e90ab7ad78952c1b1ecab8c28f79cc (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-29T16:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 2293994 bytes, checksum: e7e90ab7ad78952c1b1ecab8c28f79cc (MD5) / Aproximadamente 90% dos constituintes da peçonha botrópica e botropóica são protéicos, tratando-se de uma mistura com enorme variedade de substâncias farmacologicamente ativas que atuam na indução de alterações fisiopatológicas. Pesquisas demonstram uma grande diversidade funcional e estrutural de componentes isolados da peçonha de serpentes capazes de fornecer informações biológicas, com várias aplicações biotecnológicas como, por exemplo, antimicrobianos e antitumorais. O presente trabalho descreve a purificação, identificação e caracterização bioquímica e biológica de proteínas com atividade antimicrobiana e/ou antitumoral provenientes da peçonha de Bothropoides marmoratus. A peçonha de B. marmoratus foi fracionada com o emprego de cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa C18. Os ensaios para avaliação de atividade biológica foram realizados com a peçonha bruta e com todas as frações cromatográficas obtidas. A atividade citotóxica foi avaliada contra as linhagens celulares HeLa (câncer cervical), B16F10 (câncer de pele) e NHI3T3 (fibroblastos normais). Os ensaios para avaliação dos efeitos inibitórios sobre a proliferação de bactérias foram realizados com cinco linhagens de bactérias Gram-negativas e quatro Gram–positivas. As frações bioativas foram submetidas à recromatografia em sistema RP-HPLC para purificação dos componentes e, em seguida, analisadas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF/TOF. Os resultados indicam que a peçonha bruta de B. marmoratus, bem como algumas frações cromatográficas, apresentaram efeitos citotóxicos sobre as linhagens celulares e bactérias utilizadas. As análises por espectrometria de massa de quatro frações de interesse revelaram similaridade com uma fosfolipase A2, uma lectina do tipo-C, uma serinoprotease e com uma metaloprotease. Os resultados apontam para o potencial terapêutico da peçonha de B. marmoratus e evidencia a necessidade de estudos mais aprofundados acerca dos componentes moleculares presentes nessa peçonha. Alguns desses compostos apresentam potencial biotecnológico podendo vir a servir como modelos para o desenvolvimento de novas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Approximately 90% of the bothropic and bothropoic constituents of the venom are proteins, and it is a mixture with a variety of pharmacologically active substances that act to induce pathophysiological changes. Research shows a wide variety of functional and structural components isolated from the venom of snakes capable of providing biological information, with various biotechnological applications, for example, antimicrobial and antitumoral. This work describes the purification, identification and biochemical and biological characterization of proteins with antimicrobial and/or antitumoral activity from the Bothropoides marmoratus venom. Fractionation was performed by HPLC using a C18 reverse phase. The biological activities were carried out with crude venom and with all the chromatographic fractions obtained. The antitumor activity was tested by MTT method against the HeLa (cervical cancer), B16F10 (skin cancer) and against normal lineage NHI3T3 (fibroblasts). The antimicrobial activity assays were performed with five strains of gram-negative and four Gram-positive and all fractions of interest were subjected to a second chromatography for separation of the components present and then were analyzed by mass spectrometry MALDI TOF-TOF . The results show that the crude venom and some fractions caused the death of the cell lines tested and also the bacteria. Analysis by mass spectrometry revealed that the four fractions of interest have a similarity to phospholipase A2, a C-type lectin, a serineprotease and a metalloprotease. The results indicate the therapeutic potential of venom from B. marmoratus and shows the need to better study its components separately. Some components may be unsuitable for immediate use, but have great biotechnological potential serving as models for the development of new drugs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Química, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-03-23T17:22:20Z No. of bitstreams: 1 2011_AdaoLinconBezerraMontel_Parcial.pdf: 4175941 bytes, checksum: 3bc1665778074d61b6ebf4d287bd739b (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2012-03-26T14:48:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AdaoLinconBezerraMontel_Parcial.pdf: 4175941 bytes, checksum: 3bc1665778074d61b6ebf4d287bd739b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-26T14:48:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AdaoLinconBezerraMontel_Parcial.pdf: 4175941 bytes, checksum: 3bc1665778074d61b6ebf4d287bd739b (MD5) / A Doença de Chagas afeta cerca de 18 milhões de pessoas no mundo e é endêmica da América Latina. Devido ao desenvolvimento de resistência aos medicamentos pelo agente etiológico da doença, o protozoário Trypanosoma cruzi, a busca por novos medicamentos é de fundamental importância. As enzimas histonas deacetilase se mostraram um alvo farmacológico bastante interessante devido ao seu amplo espectro de ação bem como a baixa toxicidade dos inibidores desta enzima ao hospedeiro. Os inibidores da enzima histona deacetilase revelaram atividade importante no combate a diversas moléstias. A descoberta da alta atividade destes compostos contra infecções causadas por protozoários estimulou a busca por moléculas capazes de combater a infecção de células por protozoários. Neste trabalho fizemos uma investigação in silico do mecanismo de ação destes inibidores e investigamos a atividade in vitro de alguns deles, especialmente análogos borônicos de ácidos graxos de cadeia curta contra a infecção pelo Trypanosoma cruzi. Em paralelo a esta pesquisa, investigamos também o potencial de uso de medicamentos híbridos, isto é, compostos por dois princípios ativos em uma mesma molécula (anti-inflamatórios não esteroidais e inibidores de histona deacetilase) bem como a atividade do inibidor de transcriptase reversa nevirapina no tratamento da infecção pelo T. cruzi. O conjunto da pesquisa revelou um potencial sítio alostérico no mecanismo de ação da histona deacetilase por ácidos graxos de cadeia curta. Os análogos borônicos revelaram baixa atividade com exceção de um dos ésteres testados. O único éster a apresentar atividade, entretanto, apresentou uma toxicidade demasiada inviabilizando um uso farmacológico. A atividade dos medicamentos híbridos também se mostrou baixa. A nevirapina foi ativa contra a forma amastigota intracelular do T. cruzi. Este resultado sugere que este medicamento pode ser uma nova droga em potencial para o tratamento da cardiomiopatia da doença de Chagas. / Chagas disease affects about 18 million people worldwide and is endemic in Latin America. Due to the development of drug resistance by the causative agent of disease, the protozoan Trypanosoma cruzi, the search for new drugs is very important. The histone deacetylase enzymes proved to be a very interesting pharmacological target due to its broad spectrum of activity and low toxicity of inhibitors of this enzyme to the host. The histone deacetylase inhibitors have shown important activity in combating various diseases. The discovery of high activity of these compounds against infections caused by protozoa stimulated the search for molecules capable of fighting the infection of cells by protozoa. In this work we have done an in silico investigation of the mechanism of action of these inhibitors and investigated the in vitro activity of some, especially Boronic analogues of short-chain fatty acids against T. cruzi infection. In parallel with this research also investigated the potential use of hybrid drugs, i.e. comprising two active ingredients in the same molecule (non-steroidal anti-inflammatory drugs and inhibitors of histone deacetylase) as well as the activity of reverse transcriptase inhibitor nevirapine in the treatment of infection by T. cruzi. The survey revealed a number of potential allosteric site on the mechanism of action of histone deacetylase by short-chain fatty acids. Boronic analogs showed low activity with the exception of one of the esters tested. The only activity to produce ester however, showed an excessive toxicity invalidating a pharmacological use. The activity of hybrid drugs was also low. Nevirapine was active against the intracellular amastigote form of T. cruzi. This result suggests that this drug may be a potential new drug for tratamentto cardiomyopathy of Chagas disease.

Orientador: Jose Maria Ferreira Jardim da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Economia / Made available in DSpace on 2018-08-05T00:14:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_IzaiasdeCarvalho_M.pdf: 30756369 bytes, checksum: 43e1325d25ab1a83c4fe6ff35bb0cb43 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Nos últimos 20 anos a biotecnologia moderna, enquanto paradigma tecnológico, vem tomando-se fundamental para dois setores: agricultura e saúde humana. O Brasil país rico em biodiversidade, grande player no mercado mundial de produtos agrícolas e grande mercado para produtos farmacêuticos tem se destacado no cenário internacional pelas pesquisas no campo da engenharia genética e da genômica. Além do destaque nas "tecnologias de fronteira", o Brasil também se destacou no decorrer do século XX no campo das "biotecnologias tradicionais", como a produção de imunobiológicos (vacinas e soros) e as pesquisas em biotecnologia vegetal (cultura de tecidos, fixação biológica de nitrogênio e controle biológico de pragas). Este trabalho busca avaliar a inserção do Brasil no comércio internacional de produtos biotecnológicos depois de vinte anos da emergência das novas tecnologias e da difusão destas pelas indústrias farmacêuticas e agroquímicas. Para isso, foram utilizados dados de exportações e de importações de produtos farmacêuticos e agrícolas oriundos de processos biotecnológicos no período de 1990 a 2002. Os resultados apontam que nestes dez anos o Brasil desempenhou um papel medíocre no comércio internacional destes produtos. No setor farmacêutico o país continua sendo um grande importador de matérias-primas (fármacos e reagentes) e aumentou significativamente a importação de produtos finais (medicamentos). Alguns grupos de produtos biotecnológicos, como os antibióticos e os hormônios, foram os que apresentaram maior aumento de importações de medicamentos prontos, evidenciando claramente a tendência da indústria farmacêutica após 1995 de substituir a produção interna pelas importações. No setor agrícola, apesar do país ser um grande exportador de grãos e de outros produtos,até 2002o Brasil não estava inserido no mercado mundial de sementes e de alimentos geneticamente modificados. Esta ausência se explica basicamente pelas barreiras institucionais criadas em torno das questões relacionadas com a biossegurança, que bloqueiam as pesquisas, a produção e o comércio de produtos geneticamente modificados / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Econômicas

Membranas biológicas produzidas a partir de biomateriais tem sido amplamente estudados devido às suas aplicações na indústria farmacêutica. O objetivo do trabalho foi caracterizar membranas de colágeno modificado com extrato metanólico de frutos de Genipa americana L, denominado de ―genipina‖, suplementada com extrato etanólico de própolis vermelha e avaliar o seu potencial cicatrizante em roedores. As membranas produzidas por ―casting process‖ a partir deste polímero (COL, COLGEN e COLGENP) foram caracterizados segundo suas características morfológicas. A avaliação do processo cicatricial de feridas abertas foi realizada em 80 ratos Wistar Separados nos seguintes grupos: CTR – feridas sem cobertrura; COL – feridas cobertas com membrana de colágeno; COLGEN – feridas cobertas com membrana de colágeno reticulado com genipina; COLGENP – feridas recobertas com membrana de colágeno reticulado com genipina adicionados em 0,5% com extrato de própolis vermelha. Os animais foram sacrificados em 3, 7, 14 e 21 dias e as feridas removidas e analisadas histologicamente. Foram avaliados o índice de contração da ferida (ICF), a intensidade da reação inflamatória (IRI) e o índice de colagenização das feridas (ICG). Os dados obtidos a partir IRI foram analisados utilizando o teste Kruskal Wallis, com extensão post-hoc de Dunn, enquanto que o ICF e ICG foram analisados por meio do teste ANOVA, com extensão post-hoc de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05). Observou-se que COLG apresentou tensão máxima de ruptura e módulo de elasticidade superiores a COLGEN E COLGENP. No ensaio de cicatrização, foi observado que COLGENP induziu maior ICF que CTR em 7 dias (p= 0,04). Não houve diferença significativa na IRI entre os grupos (p<0,05), mas ambos COL, COLGEN e COLGENP promoveram cronificação mais rápida do processo inflamatório. O ICG em COLGENP foi significativamente maior que em CTR em 7 dias (0,04, respectivamente), mas não houve diferença nos demais tempos experimentais. Além disso COLGENP provocou substituição precoce do colágeno tipo II por tipo I, bem como melhor organização arquitetural das fibras de colágeno tipo I ao final do experimento. Concluiu-se que a reticulação proporcionou a produção de membranas mais plásticas provavelmente devido à diminuição de interações intracadeias. As membranas de colágeno, colágeno reticulado com genipina e colágeno reticulado com genipina mais própolis se mostraram efetivos para utilização como curativos (―dressings‖) de feridas abertas. Conquanto os resultados obtidos com ambas as membranas tenham sido estatisticamente semelhantes, é possível inferir que a reticulação química da molécula de colágeno não alterou as propriedades pró-cicatrizantes da membrana, bem como a adição de própolis vermelha._______________________________________________________________________________________ ABSTRACT: Biological membranes produced from biomaterials has been widely studied because of their applications in the pharmaceutical industry. The goal of this study was to characterize collagen membranes modified with methanol extract of fruits of G. americana L, called "genipina", supplemented with ethanol extract of propolis and evaluate its potential healing in rodents. The membranes produced by "casting process" from this polymer (COL, COLGEN and COLGENP) were characterized according to their morphological characteristics. The evaluation of the healing process of wounds was performed in 80 Wistar rats separated into the following groups: CTR - wounds without cobertrura; COL - wounds covered with collagen membrane; COLGEN - wounds covered with collagen membrane crosslinked with genipina; COLGENP - wounds covered membrane collagen cross-linked with genipina added in 0.5% extract of propolis. The animals were sacrificed at 3, 7, 14 and 21 days and the wounds removed and examined histologically. We assessed the rate of wound contraction (ICF), the intensity of the inflammatory response (IRI) and the rate of wound collagen (ICG). The data from IRI were analyzed using the Kruskal Wallis test, extending post-hoc Dunn, while the ICF ICG and were analyzed by ANOVA with post-hoc extension of Tukey. The level of significance was set at 5% (p <0.05). It was observed that had draped the maximum stress of rupture and modulus of elasticity over COLGEN and COLGENP. In the trial of healing, it was noted that ICF COLGENP induced higher CTR than 7 days (p = 0.04). There was no significant difference in IRI between the groups (p <0.05), but both COL, COLGEN COLGENP and promoted faster chronicity of the inflammatory process. The ICG COLGENP was significantly higher than in CTR in 7 days (0.04, respectively), but there were no differences in other experimental times. Moreover COLGENP caused early replacement of type II collagen by type I, and better organization of the architectural type I collagen fibers at the end of the experiment. It was concluded that the crosslinking provided the production of plastic membranes most probably due to decreased interactions intracadeias. The collagen membranes, collagen and collagen cross-linked with cross-linked with genipina genipina more propolis proved effective for use as bandages ("dressings") of open wounds. While the results obtained with both membranes were statistically similar, it is possible to infer that the chemical crosslinking of the collagen molecule did not alter the pro-healing properties of the membrane, as well as the addition of propolis.