Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-18T13:55:46Z No. of bitstreams: 1 2013_MarianaMagalhãesNóbrega_Parcial.pdf: 4669193 bytes, checksum: 470b6e88d4408bfc14b01984e61c33ac (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-24T13:51:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarianaMagalhãesNóbrega_Parcial.pdf: 4669193 bytes, checksum: 470b6e88d4408bfc14b01984e61c33ac (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-24T13:51:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarianaMagalhãesNóbrega_Parcial.pdf: 4669193 bytes, checksum: 470b6e88d4408bfc14b01984e61c33ac (MD5) / A prospecção de peptídeos com atividade biológica é importante do ponto de vista biotecnológico assim como ponto de partida em diversos ramos da pesquisa como no desenvolvimento de novas drogas e na produção de plantas geneticamente modificadas. Este trabalho tem como objetivo a predição e a síntese de peptídeos que tenha atividade antinociceptiva e hipotensora. A predição da estrutura primária dos peptídeos foi realizada com base em trabalhos anteriores do grupo, os quais focam na prospecção e caracterização de peptídeos bioativos, assim como no conhecimento disponível na literatura acerca das propriedades biológicas apresentadas por domínios protéicos específicos. Os peptídeos foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, utilizando a estratégia Fmoc, seguida da purificação em cromatografia líquida de alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação da estrutura primária dos peptídeos sintetizados foram determinados por espectrometria de massa, Maldi e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos , por via intraperitoneal com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva, realizaram-se então os testes da placa quente ou Hot Plate e teste de retirada da cauda ou Tail Flick. Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva via receptores opióides com perfil de atividade mais tardio e duradouro em relação a morfina. Eles apresentaram atividade nos dois modelos de testes propostos, podem ter atravessado a barreira hematoencefálica e possuem ação prolongada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / To prospect of peptides with biological activity is important from the point of view of biotechnology as a starting point in many fields of research as the development of new drugs and the production of genetically modified plants. This study aims to predict and synthesize peptides that have antinociceptive and hypotensive activities. The prediction of the primary structure of the peptides was based on previous work of the group, which focuses on the prospection and characterization of bioactive peptidesas well as in the knowledge available in the literature about the biological properties of specific protein domains. The peptides were synthesized by solid-phase chemical synthesis using Fmoc strategy followed by purification on high performance liquid chromatography. The purity and confirmation of the primary structure of the synthesized peptides were determined by mass spectrometry, MALDI and ESI.The peptides were injected in mice intraperitoneally in order to assess its possible antinociceptive activity through Hot Plate and Tail Flick assays.The in vivo tests showed that synthetic peptides PSLEM 11011 and 11012 have antinociceptive activity via opioid receptors with delayed response and longer activity compared to morphine. The peptides showed activity in both test models proposed in this work, may have crossed the blood-brain barrier and presenting high bioavailability.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-20T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) Previous issue date: 2017-10-24 / A caracterização de peptídeos encriptados em proteínas pode ser uma estratégia que possibilita diversas aplicações na biotecnologia, que vão desde o desenvolvimento de novos fármacos até a produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo tem como objetivo geral a prospecção, bem como, o desenho de novas moléculas a partir de peptídeos encriptados em proteínas que possam apresentar atividades biológicas. Dessa forma, foram desenhados dois peptídeos que apresentam dupla atividade (opioide e hipotensora). Tais peptídeos foram sintetizados isoladamente e também de maneira que formassem uma única cadeia polipeptídica, dando origem a uma pequena proteínas de 35 resíduos contendo duas pontes dissulfeto denominada MTOXI. O objetivo do desenho da MTOXI é a otimização da atividade frente à ação de proteases, permitindo uma liberação possivelmente controlada de peptídeos. Tanto os peptídeos separadamente, quanto a proteína MTOXI foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, seguida da purificação em cromatografia líquida em alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação foram determinados por espectrometria de massa, MALDI e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos por via intraperitoneal, com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva nos testes da placa quente (Hot Plate) e teste de retirada da cauda (Tail Flick). Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva com perfil de atividade mais lento e duradouro em relação à morfina. A proteína MTOXI foi digerida com tripsina, em quadruplicatas, sendo avaliado o perfil de proteólise e liberação dos fragmentos peptídicos durante uma hora. O ensaio da digestão foi analisado por LC-MS incluindo os controles positivo (digestão da proteína reduzida) e negativo. A área de cada fragmento no respectivo tempo foi determinada. Os peptídeos bioativos permaneceram íntegros durante o processo de digestão e apresentaram aumento na área ao longo do tempo, o que sugere que a estratégia desenvolvida é promissora para a liberação controlada de peptídeos e para otimização do perfil de atividade. Posteriormente foi iniciada a expressão de peptídeos antimicrobianos encriptados no genoma de Arabidopsis thaliana (planta modelo) para serem reinseridos no genoma da própria planta com o objetivo de diminuir a suscetibilidade da planta contra o fungo Botrytis cinerea. A utilização de peptídeos encriptados para desenhar peptídeos e proteínas com atividade biológica mostrou-se promissora para futuras aplicações biotecnológicas. / The characterization of encrypted peptides from source proteins can be a strategy that enables several biotechnological applications, ranging from the development of new drugs to the production of genetically modified organisms. The following work aimed at prospecting and designing new molecules using peptides encrypted in proteins that may present biological activities. Thus, two peptides with dual activity (opioid and hypotensive) were designed and subsequently inserted into a small protein (MTOXI) with two dissulfide bridges, in order to optimize activity against the action of proteases and allowing a controlled release of the peptides. The peptides and the MTOXI protein were synthesized by chemical solid-phase synthesis using the fmoc strategy, followed by High Performance Liquid Cromatography (HPLC) purification. The purity and sequence confirmation were determined by MALDI and ESI mass spectrometry. The peptides were intraperitoneally injected in mice with the purpose of evaluating the antinociceptive activity via Hot plate and Tail Flick tests. In the in vivo assays, the synthetic peptides PSLEM 11011 and PSLEM 11012 presented antinociceptive activity with a later and long-lasting activity profile compared to morphine. The MTOXI protein was digested with trypsin, in four replicates, and the proteolysis profile and peptide fragment release analyzed during 5, 10, 15, 30, 45 and 60 minutes. The digestion assay was analyzed in each time by LC-MS, including the positive (reduced protein digestion) and negative controls. Determination of the area of each fragment in the respective time was obtained and disulfide pair formation identified. Bioactive peptides remained intact during the digestion process and showed increased area over time, which suggests that the developed strategy for the controlled release of peptides and optimization of activity profile is promising. Later, the identification and selection of peptides with antimicrobial physicochemical properties, encrypted in the genome of Arabidopsis thaliana was conducted. These peptides were reintroduced into A. thaliana´s own genome aiming at reducing plant susceptibility to the pathogen Botrytis cinerea. The use of encrypted peptides to design peptides and proteins with biological activity has shown promise for future biotechnological applications.

Made available in DSpace on 2016-11-30T14:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 109333_Eloise.pdf: 1146911 bytes, checksum: aebe4f18593441f112e859dfb24d074c (MD5) license.txt: 214 bytes, checksum: a5b8d016460874115603ed481bad9c47 (MD5) Previous issue date: 2014 / O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um distúrbio neuropsiquiátrico com base biológica significativa, que se desenvolvem primeiros três anos de vida. O sistema opióide endógeno faz parte de uma família de neuropeptídios com ação em receptores específicos que estão distribuídos no SNC e tecidos periféricos. Este sistema regula diversas funções fisiológicas, entre elas, os níveis de ansiedade, caráter depressivo, perfil locomotor, memória, comportamento e atua no desenvolvimento do SNC, com participação na proliferação, migração e diferenciação celular cerebral. Os opióides, pelas suas ações, parecem estar envolvidos nos processos ligados às disfunções comportamentais observadas no TEA, em particular o sistema N/OFQ-receptor NOP. O UFP-101 é um antagonista do receptor NOP que se liga com alta afinidade e seletividade superior a 3000 vezes mais que os receptores opióides clássicos, para o receptor NOP. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração central de UFP-101, sobre parâmetros comportamentais e neuroquímicos de ratos Wistar submetidos ao modelo animal de autismo através da exposição pré-natal de ácido valpróico (VPA). Os resultados demonstraram que a administração pré-natal ao VPA no dia 12º gestacional foi capaz de produzir padrões comportamentais estereotipados (movimentos de grooming) e prejuízo na interação social em ratos jovens. A administração central de UFP-101 na dose de 2µL nos animais do grupo expostos ao VPA em período pré-natal reduziu significativamente o número de movimentos de crossing, porém não alterou de forma significativa o número e o tempo de grooming, número de rearing, número de visitas ao centro e número de bolo fecal. A atividade da cadeia respiratória mitocondrial dos complexos I e II não foram alteradas pela administração de UFP-101, no entanto, na atividade do complexo IV ocorreu a inibição no córtex pré-frontal, além disso após a administração deste antagonista, ocorreu uma diminuição na atividade da creatina quinase (CK) no hipocampo e córtex pré-frontal. Os conjuntos desses resultados revelam que o VPA é um importante modelo experimental de comportamento autista e que o bloqueio do neuropeptídeo NOP, através do antagonista UFP-101 não reverteu à maioria dos parâmetros analisados. / The Autistic Spectrum Disorder (ASD) is a neuropsychiatric disorder with significant biological basis, which develop first three years of life. The endogenous opioid system is part of a family of neuropeptides that act on specific receptors which are distributed throughout the CNS and peripheral tissues. This system regulates various physiological functions, including levels of anxiety, depressive character, locomotor profile, memory, behavior and acts in CNS development, with participation in the proliferation, migration and brain cell differentiation. Opioids, by their actions, seem to be involved in processes linked to behavioral dysfunction observed in ASD, in particular the N/OFQ-NOP receptor system. The UFP-101 is an antagonist of NOP receptor which binds with high affinity and greater selectivity to 3000 times more than the classical opioid receptors, for the NOP receptor. The aim of this study was to investigate the effects of central administration of UFP-101 on behavioral and neurochemical parameters of Wistar rats submitted to an animal model of autism by prenatal exposure to valproic acid (VPA). The results showed that pre-natal administration to VPA on day 12 gestation were capable of producing stereotyped patterns of behavior (movement grooming) in the social interaction and impairment in young rats. The central administration of UFP-101 at a dose of 2µL in group exposed to VPA in the prenatal period significantly reduced the number of crossing movements, and did not change significantly the number and the time of grooming, number of rearing, number of visits to the center and number of fecal matter. The activity of the mitochondrial respiratory chain complexes I and II were not altered by the administration of UFP-101, however, in complex IV inhibition activity occurred in the prefrontal cortex, moreover after administration of the antagonist, there was a decrease in activity of creatine kinase (CK) levels in the hippocampus and prefrontal cortex. The combination of these results suggest that VPA is an important experimental model of autistic behavior and that blocking neuropeptide NOP through the antagonist UFP-101 did not revert to the most parameters.