Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole. The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL), and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M. leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1 have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance. Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable, differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other human antibodies. The serological tests of household contacts for this same phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina (inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo, contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5% de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica

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O objetivo do presente estudo foi analisar a reatividade de diferentes antígenos em casos novos de hanseníase, contatos domiciliares de casos e em população de área endêmica, com o intuíto de identificar o melhor antígeno para o diagnóstico sorológico da hanseníase e detecção de indivíduos infectados pelo Mycobacterium leprae. Trata-se de um estudo transversal de natureza exploratória e analítica. A reatividade anti-LID1, NDO-LID, NDO-HSA e PGL-1 foi avaliada por meio do enzyme-linked immunosorbent assay. Foram analisadas amostras de sangue total em papel de filtro Whatman de 2494 indivíduos da população de sete municípios da microrregião de Almenara e de soro de 94 casos novos de hanseníase e 104 contatos domiciliares de casos residentes no município de Uberlândia. O Banco de Dados foi criado no Software Epi Info versão 3.5.1 e análise realizada no software Statistical Package for the Social Sciences for Windows 18 e no GraphPad Prism versão 5. Para análise estatística foram utilizados os seguintes testes: Kolmogorov-Smirnov, Kruskal-Wallis one-way (H), Mann-Whitney (U) com correção de Bonferroni, kappa, Spearman (rho), teste Qui-quadrado de Pearson e regressão logística binária. Foi observado maior soropositividade no grupo de casos multibacilares (MB), em contatos domiciliares de casos MB e nos indivíduos residentes nos municípios de Almenara e Jequitinhonha. Obteve-se correlação positiva entre a sorologia e o índice baciloscópico, concordância substancial e significativa no grupo de casos novos de hanseníase e correlação positiva para todos os antígenos testados. Os testes anti-LID-1 e anti-NDO-LID apresentaram melhor performance para identificar os contatos domiciliares e ou indivíduos da população infectados pelo M. leprae. O PGL-1 nativo teve maior positividade do que o NDO-HSA para todas as formas clínicas da hanseníase e no grupo de contatos domiciliares. A prevalência de soropositividade na população foi superior à taxa de detecção de casos de hanseníase em todos os municípios avaliados. A faixa etária, a renda familiar, residir em município endêmico, conhecer alguém que teve ou tem hanseníase, ter ou ter tido caso de hanseníase na familia e residir ou ter residido com caso de hanseníase são fatores que podem explicar a diferença de soropositividade anti-NDO-LID. Apenas a faixa etária e conhecer alguém que teve ou tem hanseníase é capaz de explicar a diferença de soropositividade anti-NDO-HSA. E em relação ao LID-1 nenhuma variável foi explicativa. Todos os antígenos analisados podem auxiliar na diferenciação e caracterização da hanseníase MB e na identificação de indivíduos expostos ao M. leprae, porém o NDO-LID apresentou melhor performance na identificação desses indivíduos e dos casos paucibacilares, quando comparado aos testes envolvendo os antígenos LID-1 e NDO-HSA separadamente, portanto fornece benefício adicional a esses antígenos e poderia ser utilizado como ferramenta auxiliar na vigilância epidemiológica da hanseníase. / The subclinical infection can be evaluated by serologic test which determine circulating immunoglobulins. The aim of this study was to analyze the reactivity of different antigens in leprosy cases, household contacts of index cases and the population of the endemic area to identify the best antigen for the diagnosis of leprosy and detection of individuals infected with Mycobacterium leprae. It is a cross-sectional study of exploratory and analytical nature. The reactivity anti-LID-1, NDO-LID, NDO-HAS e PGL-1 were evaluated using the enzymelinked immunosorbent assay. The whole blood in Whatman filter paper of 2494 individuals from the general population of seven municipalities in the micro-Almenara and serum of 94 patients with leprosy and 104 household contacts of patients residing in Uberlândia were analyzed. The database was created in Epi Info software version 3.5.1 and analysis in the software Statistical Package for Social Sciences for Windows 18 and GraphPad Prism version 5. For statistical analysis the following tests were used: Kolmogorov-Smirnov, Kruskal Wallis one-way (H), Mann-Whitney (U) with Bonferroni correction, kappa, Spearman (rho), chisquare test of Pearson and binary logistic regression. Identied higher seropositivity in the group of MB patients, household contacts of MB patients and in individuals living in the municipalities of Almenara and Jequitinhonha. Observed positive correlation between serology test and bacterial index, substantial agreement and significant in patients positive and positive correlation for all antigens. The LID-1 and NDO-LID antigens showed greater ability to identify household contacts or the general population infected with M. leprae, but the performance of the NDO-LID was better. The native PGL-1 had higher seropositivity than the NDO-HSA for all clinical forms of leprosy and household contacts. The seropositivity prevalence in the general population was higher than the detection rate of leprosy cases in all evaluated municipalities. The age, family income, living in a city endemic, knowing someone who had or has leprosy, had or have the case in the family and live or lived with leprosy case are factors that can explain the anti-NDO-LID seropositivity difference. Only the age range and know someone who had or has leprosy is able to explain the anti-NDO-HSA seropositivity difference. And for the LID-1 no variable explained the anti-LID-1 seropositivity difference. All serological tests analyzed can assist in the differentiation and characterization of MB leprosy and the identification of individuals exposed to M. leprae, but NDO-LID performed better in identifying these individuals and PB patients, when compared to the tests involving the LID-1 and NDO-HSA antigens separately, therefore provides additional benefit to these antigens and could be used as an auxiliary tool in epidemiological surveillance of leprosy.

Introdução: As reações hansênicas caracterizam-se por eventos imunológicos agudos que ocorrem antes, durante ou após a Poliquimioterapia da hanseníase, sendo desencadeadas principalmente pela interação entre os antígenos do Mycobaterium leprae, PGL-1 e LAM, com os componentes da imunidade do hospedeiro, TLR1 e TLR2, que consequentemente induzem outras células a sintetizar citocinas que favorecem o controle ou disseminação bacilar. Objetivos: Estabelecer e quantificar as relações causais entre os antígenos de M. leprae (PGL-1 e LAM) e os receptores TLR1, TLR2 e seus efeitos na expressão de citocinas IFN-γ e IL-10 nas reações hansênicas. Material e métodos: Por meio da sorologia ELISA foi possível dosar os níveis de IgM anti-PGL-1 e IgG anti-LAM e com emprego da RT-qPCR procedeu-se a análise da expressão gênica de TLR1, TLR2, IFN-γ e IL-10 utilizando amostras do sangue de 17 pacientes com reação hansênica e 17 sem reação (caso-controle) que posteriormente foram subdivididos em 4 grupos. Na comparação entre as médias das variáveis nos diferentes grupos, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) e na avaliação do grau de associação entre as principais variáveis, a matriz de correlação de Pearson. Ao final, elaborou-se a análise de trilha para verificar relações causais envolvendo os antígenos e receptores do tipo Toll tendo como efeitos direto e indireto a expressão de citocinas. Resultados: Do total de 34 pacientes, 76,4% (26/34) eram MB e 23,6% PB, sendo que 100% (17/17) dos casos reacionais eram MB e dos controles 53% (9/17). Analisando o grupo reacional, 41,2% (7/17) apresentaram reação tipo 1, enquanto que 58,8% (10/17) tiveram reação tipo 2, destacando que na reação tipo 1, 57,1% (4/7) dos pacientes tiveram reação antes do tratamento (downgrading), 14,2% (1/7) durante e 28,8% (2/7) após PQT. Na reação tipo 2, todos desenvolveram reação após alta. Os níveis de anti-PGl-1 estiveram elevados na reação tipo 1 e na reação tipo 2, com diferença significativa entre as médias desses grupos quando comparados aos controles PB (F=6,42; p=0,002). Em relação ao anti-LAM, esse esteve associado a reação do tipo 2, grupo cujas médias foram mais elevadas, e apresentaram diferenças significativas quando comparado aos demais grupos (F=15,27; p<0,001). Os grupos reacionais expressaram maiores níveis de mRNA de IL-10 (F=3,99; p=0,023), enquanto que o grupo controle expressou mais IFN-γ, especialmente aqueles PB (F=5,30; p=0,008). Não houve diferenças nos níveis de expressão de TLR1 e TLR2 nos diferentes grupos. No grupo reacional, a análise de trilha quantificou os efeitos diretos de anti-LAM (0,623) e anti-PGL-1 (0,605) sobre TLR2, maiores que o efeito residual desse modelo (0,255), indicando que esses marcadores antigênicos influenciaram somente a expressão de TLR2, que consequentemente associou-se a IL-10 nesse grupo. Um mecanismo oposto ocorreu no grupo controle, visto que, constatou-se uma via imunológica que regulou a expressão de IFN-γ dependente da associação entre TLR1-TLR2. Conclusão: Em conclusão, a análise de trilha permitiu demonstrar a relação causal entre antígenos, TLR2 e IL-10 nas reações hansênicas, que podem sofrer influência de falha no mecanismo de associação entre TLR1 e TLR2, objeto de futuras investigações. / Background: The leprosy reactions are acute immunological events that occur before, during or after MDT of leprosy, being triggered mainly by interaction between the antigens of Mycobacterium leprae, PGL-1 and LAM, with the components of immunity of the host, such as, TLR1 and TLR2, that induce cells to produce cytokines related to control or bacillary dissemination. Objectives: The main goal of this research is establish causal relations between antigens of M. leprae (PGL-1 and LAM) and receptors, TLR1, TLR2 and their effects on cytokines expression, IFN-γ and IL-10, in leprosy reactions. Methods: Through ELISA serology it was possible measure the levels of anti-PGL-1 IgM and anti-LAM IgG, and with the use of the RT-qPCR proceeded the analysis of gene expression of TLR1 TLR2, IFN-γ and IL-10 using blood samples from 17 reactional patients and 17 nonreactional patients (Case-control study) that posteriorly were subdivided into 4 groups. For comparison between means of the variables, it resorted to use of analysis of variance (ANOVA) and about the degree of association between the variables, it has applied the correlation matrix. At the end, it was used the path analysis to verify the causal relation evolving antigens and toll-like receptors, whose the direct and indirect effects were the cytokines expression. Results: Among 34 patients, 76.4% (26/34) were MB and 23.6% PB, being that 100% (17/17) of reactional cases were MB and among the controls 53% (9/17). Analyzing the reactional group, 41.2% (7/17) suffered type 1 reaction, while 58.8% (10/17) presented type 2 reaction, emphasizing that, among patients with type 1 reaction, 57.1% (4/7) had reaction before treatment (downgrading), 14.2% (1/7) during and 28.8% (2/7) after MDT, whereas all patients of the type 2 reaction group, developed this occurrence after treatment. The levels of anti-PGl-1 have been elevated in type 1 and type 2 reactions with significant differences between means of these groups when compared to PB controls (F=6.42; p=0.002). Regarding to anti-LAM, this has been associated to type 2 reaction, group whose the means were higher than others, and this data showed significant differences as well (F=15.27; p<0.001). The reactional groups expressed higher levels of IL-10 (F=3.99; p=0,023), whereas the control group produced high levels of IFN-γ, especially the PB control (F=5.30; p=0.008). There were no differences in the levels of TLR1 and TLR2 expression in the comparison among groups. In the reactional group, the path analysis quantified the direct effects of anti-LAM (0.623) e anti-PGL-1 (0.605) on TLR2, which were higher than the residual effect of this model (0.255), indicating that these antigenic markers influenced only the TLR2 expression, which consequently correlated with the IL-10 expression in this group. An opposing mechanism occurred in the control group, insofar as it was found an immunological pathway that regulated the IFN-γ expression dependent on TLR1 and TLR2 association. Conclusion: In conclusion, path analysis allowed to demonstrate the causal relation between TLR2 and IL-10 in leprosy reactions that may suffer influence of failure in the mechanism of association between TLR1 and TLR2, as such occurs in TLR2 polymorphisms, object of future investigations. / Tese (Doutorado)