La recirculación del potasio (K+ ) es un proceso indispensable para la audición, que tiene
lugar en el órgano de Corti (OC). Ante la presencia de estímulos sonoros, el K+ ingresa a
las células ciliadas, despolarizándolas. Luego, este ion es extruido de estas células,
atravesando las células de soporte y la stria vascularis, desde donde es secretado
nuevamente hacia la endolinfa. La salida de K+ de las células ciliadas externas (CCEs) es
llevada a cabo fundamentalmente por el canal Kv7.4. Estos están formados por 4
subunidades iguales codificadas por el gen Kcnq4, que se disponen en forma de anillo y
delimitan un poro en el centro a través del cual ocurre el paso selectivo de K + . La sordera
DFNA2 es causada por mutaciones en Kv7.4. Esta enfermedad se desarrolla como una
pérdida auditiva (PA) neurosensorial de herencia autosómica dominante que progresa con
la edad, produciendo una sordera leve a moderada en las etapas iniciales, hasta alcanzar
una sordera profunda que comienza alrededor de los 50 años en las frecuencias sonoras
altas. En sus comienzos, la PA alcanza hasta 60 dB de intensidad, lo cual correlaciona con
un mal funcionamiento de las CCEs. Luego, en la adultez, la sensibilidad auditiva disminuye
aún más, indicando que otros mecanismos intervienen en la PA. Hasta el momento, no está
claro cuáles son las consecuencias a nivel celular y molecular del mal funcionamiento o de
la ausencia de los canales Kv7.4 en las células ciliadas. Además, los modelos animales
empleados para el estudio de esta patología no han logrado ser útiles para descubrir los
eventos que causan la PA avanzada. En esta tesis, se descifraron nuevos roles
funcionales que cumplen los canales Kv7.4 en las CCEs y en el oído interno y se
dilucidaron los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la degeneración
celular en las dos etapas de la sordera. Como modelo de estudio de la enfermedad, se
emplearon ratones de la cepa C3H que carecen de la expresión de los canales Kv7.4
(Kcnq4-/-).
El capítulo I se enfocó en el análisis de la degeneración tisular en la cóclea de los
animales Kcnq4-/-, cuyo alelo se expresó en la cepa murina C3H/HeJ. En primer lugar,
analizamos si la expresión de los canales Kv7.4 en la cóclea de los ratones C3H WT y la
funcionalidad del sistema auditivo era similar a la reportada para otras cepas. Mediante
inmunofluorescencia (IF) y PCR cuantitativa (qPCR) se encontró que esta proteína se
localiza en las CCEs del OC y su expresión es más intensa en el giro coclear basal (GCB).
A través de la tecnología de super resolución del microscopio confocal, se pudo determinar
que estas proteínas se localizan en la membrana plasmática del polo basal de las CCEs
mientras que PRESTINA, la proteína motora de las CCEs, se sitúa en la membrana
plasmática lateral. A nivel histológico y funcional, se notó que la cepa C3H conserva las
células ciliadas y su función auditiva por lo menos, hasta el año de edad, lo cual permitió
utilizarla para evaluar los mecanismos que intervienen en la sordera causada por ausencia
de Kv7.4, excluyendo la influencia de la edad. En segundo lugar, se realizó la
caracterización espacio-temporal de la supervivencia de las células ciliadas mediante
citococleogramas y de las neuronas del ganglio espiral (NGEs) en ratones WT y Kcnq4 -/-.
Se detectó que en los animales Kcnq4-/-, las CCEs degeneran progresivamente a lo largo
de toda la cóclea, comenzando en el GCB a edades jóvenes, tan pronto como a las 3
semanas de edad (W). También se determinó la velocidad de degeneración de las CCEs
en las distintas regiones cocleares. Esta es mucho mayor en el GCB y disminuye hacia el
ganglio coclear apical (GCA), en correlación con el gradiente de expresión de Kv7.4. El
análisis de supervivencia celular reveló que el número de las CCIs disminuye a partir de las
40 W, al igual que las NGEs. Si bien estas células degeneran 37 W más tarde, su velocidad
de desaparición es más acelerada. Además, se evaluó la superficie de ambos tipos de
células ciliadas a nivel ultraestructural, mediante microscopía electrónica de barrido. Al
emplear esta técnica, se descubrieron diferentes alteraciones en los estereocilios de las
mismas que podrían afectar la mecanotransducción y transducción de los sonidos, las
principales funciones que realizan las CCEs y las células ciliadas internas (CCIs),
respectivamente. Por otro lado, se descubrió que Kv7.4 podría contribuir con la
compartimentalización de proteínas como PRESTINA.
El capítulo II se centró en el estudio de los mecanismos de muerte celular que conducen
a la pérdida de las células ciliadas y de las NGEs, en la estimación de la función auditiva
de los ratones Kcnq4-/- de distintas edades y en determinar si la sobreestimulación de su
sistema auditivo genera mayores daños en el OC. También se evaluó el efecto de una
sobreestimulación del sistema auditivo de estos animales mediante un ensayo de trauma
acústico. Empleando la técnica de IF, se analizó la vía autofágica y apoptótica. Como
resultado, no se encontró activación de autofagia en la cóclea de los Kcnq4-/- jóvenes ni
maduros, pero sí se detectó que la apoptosis es una vía activa en las CCEs a edades
tempranas y en las NGEs a edades maduras, lo cual contribuye a explicar la disminución
en la supervivencia de estas células. Mediante qPCR, se descubrió que los niveles de
expresión del gen proapoptótico Bax se encuentran elevados, mientras que los del gen
antiapoptótico Bcl-2 están disminuidos en la cóclea Kcnq4-/-. Este hallazgo permite inferir
que la activación de la vía apoptótica intrínseca causa la muerte celular en el OC Kcnq4-/-.
Para complementar el análisis histológico y evaluar la función auditiva de nuestro modelo
animal Kcnq4-/- se realizaron dos ensayos: uno cualitativo y otro cuantitativo. El primero,
consistió en la prueba del reflejo de Preyer, que permite estimar si un animal padece de
sordera profunda. A través de este, se notó que a medida que progresa la edad, la cantidad
de ratones Kcnq4 -/- que no responden al estímulo sonoro, se incrementa. Estos resultados
indican que la sordera es progresiva con la edad en los animales Kcnq4 -/-. Las pruebas
auditivas cuantitativas incluyeron el test de respuesta auditiva del tronco cerebral (ABRs) y
el de emisiones otoacústicas producto de la distorsión (DPOAEs). Se determinó que la
función auditiva de los Kcnq4-/- jóvenes está desmejorada ya que los umbrales auditivos
aumentaron 20-40 dB en la región coclear de mayor sensibilidad. Además, el ensayo de
DPOAEs mostró un aumento de 20 dB en el umbral. Estos datos indican que en etapas
tempranas hay un funcionamiento defectuoso de las CCEs. La audición empeora aún más
en los Kcnq4 -/- maduros, que mostraron umbrales auditivos mayores a 80 dB, señalando
que estos padecen de sordera profunda, lo cual involucra no sólo un mal funcionamiento
de las CCEs, sino también de los componentes de la vía auditiva aferente. A nivel
histológico, los Kcnq4 -/- jóvenes únicamente mostraron degeneración de las CCEs en el
GCB y defectos en los estereocilios de ambas células ciliadas. Mientras que, en los
animales de mayor edad, la degeneración de las CCEs progresa afectando toda la longitud
del OC, y la supervivencia de las CCIs y NGEs también disminuye en el GCB y ganglio
coclear apical. Debido a que los resultados obtenidos a nivel tisular no lograron explicar
completamente los obtenidos a nivel funcional, se realizó un análisis supraumbral de los
registros de ABR. Este análisis permitió estudiar los mecanismos que intervienen en el
procesamiento de la señal auditiva una vez que esta se transmite por la vía aferente, hacia
el nervio auditivo. Se determinó que, a edades jóvenes, los ratones Kcnq4 -/- exhiben una
reducción en la amplitud de los picos (P) P1, P2 y P5 para frecuencias medias y altas, lo
cual revela alteraciones en la transmisión eléctrica de las señales sonoras en el giro coclear
medio (GCM) y GCB. Como mecanismos de compensación ante la degeneración celular
que ocurre en el OC, descubrimos que existe una hiperactividad a nivel del sistema nervioso
central (SNC) para determinadas frecuencias sonoras. A edades maduras, también
hallamos que las amplitudes de los distintos picos de la ABR están reducidas, pero a
diferencia de lo notado en animales jóvenes, este decremento ocurre a lo largo de toda la
cóclea y es generado por la disfunción y degeneración de las CCIs y NGEs. Para analizar
la sensibilidad de la cóclea de los animales Kcnq4-/- frente a ruidos intensos, se llevó a cabo
un ensayo de trauma acústico. Como resultado, se descubrió que, si bien la exposición a
ruidos provocó degeneración y muerte celular de las CCEs por apoptosis en los ratones
Kcnq4-/-, estos eventos no provocaron un daño mayor al ya existente debido a la ausencia
de los canales Kv7.4.
Los hallazgos presentados en esta tesis contribuyen a descifrar los eventos a nivel celular
y molecular que intervienen en las distintas fases de la sordera causada por la ausencia de
Kv7.4. En la etapa temprana (juvenil) hay una pérdida auditiva leve a moderada. De acuerdo
a los mecanismos que se reportan aquí, esta etapa puede subdividirse en tres fases: una
temprana, en la que ocurre la disfunción de las células ciliadas debido a despolarización,
deslocalización de PRESTINA en las CCEs, y alteraciones en el haz de estereocilios; una
intermedia, en la que se activa la vía apoptótica y una tardía, donde tiene lugar la muerte
de las CCEs. Finalmente, en la segunda etapa de la PA, hay una sordera profunda
producida por la degeneración de las CCIs y NGEs. Si bien existen modelos animales que
portan mutaciones equivalentes a las encontradas en humanos, estos no han logrado
explicar la PA avanzada. El empleo del ratón Kcnq4-/- nos ha permitido descubrir los eventos
que tendrían lugar en ambas fases de la PA, y especialmente, en la segunda, los cuales
eran desconocidos hasta el momento. Adicionalmente, estos resultados ayudan a
comprender los eventos que subyacen otros tipos de PA que comparten una progresión
similar a la sordera DFNA2 / Potassium (K+
) recirculation is an indispensable process for the audition, which takes place
in the organ of Corti (OC). In the presence of auditory stimuli, K+ enters the hair cells,
depolarizing them. Then, this ion is extruded out from these cells, moving through the
supporting cells and the stria vascularis, from where it is secreted again to the endolymph.
K+ exit from the outer hair cells (OHCs) is carried out mainly by Kv7.4 channels. These
proteins are formed by four equal subunits, which are codified by the Kcnq4 gene, and are
arranged in a ring shape, delimiting a pore in the center through which occurs the selective
entrance of K+ . DFNA2 deafness is caused by Kv7.4 mutations. This disease develops as a
neurosensorial hearing loss (HL) and it inherits as an autosomal dominant disorder, which
is progressive through age. It produces a mild to moderate HL in the initial stage until it
reaches profound deafness which starts around 50-year-old in the high frequencies. In the
beginning, HL reaches an intensity of 60 dB, which correlates with the inappropriate
functioning of OHCs. Then, in adulthood, auditory sensitivity reduces, even more, indicating
that other mechanisms develop in HL. So far, it is not clear which are the consequences at
the cellular and molecular level of the malfunctioning or absence of the Kv7.4 channels in
the hair cells. Additionally, the animal models used for the study of this pathology, are not
useful to discover the events causing advanced HL. In this thesis, we deciphered new
functional roles of Kv7.4 channels in the OHCs and the inner ear and we elucidated
the molecular and cellular mechanisms underlying cell degeneration in the two
phases of deafness. As an animal model for this disease, we use C3H mice lacking Kv7.4
expression (Kcnq4 -/-).
Chapter I focused on the analysis of tissue degeneration in the cochlea of Kcnq4-/- animals,
whose allele was expressed in the C3H/HeJ mouse strain. First, we studied if Kv7.4 channel
expression in the WT mice and the auditory system function were similar to those reported
in other strains. By using immunofluorescence (IF) and quantitative PCR (qPCR) we found
that this protein is localized in the OHCs of the OC and its expression is more intense in the
basal cochlear turn (BCT). Through the super-resolution technology of the confocal
microscope, we determined that these proteins are localized in the plasma membrane of the
OHC basal pole, while PRESTIN is situated in the lateral plasma membrane. At the
functional and histological level, we discovered that the C3H strain preserves the hair cells
and its auditory sensitivity for at least, to one-year-old. This allowed us its use to evaluate
the mechanisms participating in the HL caused by Kv7.4 absence, excluding the age factor.
Then, we performed the spatio-temporal characterization of the hair cell survival by
cytococleograms. and of the spiral ganglion neuron (SGN) survival in WT and Kcnq4 -/- mice.
We detected that in young Kcnq4-/- mice, OHCs degenerate progressively along the cochlea,
starting at the BCT, as soon as 3-week-old (W). Moreover, we determined the speed of CCE
degeneration in the different cochlear regions. This is greater in the BCT and it reduces
towards the apical cochlear turn (ACT), correlating with the Kv7.4 gradient expression. The
survival analysis revealed that the IHC number reduces from 40 W, in the same way as
SGNs. Even though these cells degenerate 37 W later, their velocity of death is more
accelerated. Moreover, we investigated the surface of both types of hair cells at the
ultrastructural level, by scanning electron microscopy. By using this technique, we
discovered different alterations in the hair cell stereocilia, which could affect the
mechanotransduction and sound transduction, the main functions of these cells,
respectively. On the other hand, we found that Kv7.4 channels may contribute to PRESTIN
compartmentalization given that their absence produces its mislocalization.
Chapter II focused on the study of the cellular death mechanisms leading to the loss of
hair cells and SGNs; on the auditory function estimation of Kcnq4 -/- mice at different time
points, and on determining if auditory overstimulation produces more damage in the OC. By
IF, we analyzed the autophagic and apoptotic pathways. As a result, we did not find
autophagy activation in Kcnq4-/- cochlea from young and middle-aged mice. However, we
detected apoptosis activation in the OHCs from young mice and in the SGNs from middle-
aged animals, which contributes to explaining their reduced survival. By qPCR, we
discovered that the expression levels of the proapoptotic gene Bax are elevated, while those
of the antiapoptotic gene Bcl-2 are reduced in the Kcnq4-/- cochlea. These findings allowed
us to infer that the activation of the intrinsic apoptotic pathway causes cellular death in the
Kcnq4-/- OC. To complement the histological analysis and to evaluate the auditory function
in our animal model, we used two tests, one qualitative and the other quantitative. The first
one consisted of Preyer’s reflex test, which allowed us to estimate if an animal suffers from
profound HL. Through this, we found that as age progresses, the amount of Kcnq4 -/- mice
that do not respond to the stimulus, increases. These results indicate that HL is progressive
with age in the Kcnq4 -/- animals. The quantitative auditory tests include the auditory
brainstem response (ABR) and the distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). By
using these tests, we discovered that auditory sensitivity is impaired in the young Kcnq4 -/-
mice given that auditory thresholds elevate 20-40 dB in the most sensitive cochlear region.
This data indicates that since young ages there is an altered function of CCEs. The audition
impairs even more in the middle-aged mice, which showed auditory thresholds greater than
80 dB, indicating that these animals suffer from profound deafness. This involves not only
the malfunction of OHCs but also of the afferent auditory pathway components. At the
histological level, young Kcnq4-/- mice showed OHC degeneration in the BCT and stereocilia
defects in both types of hair cells. While in the older animals, OHC degeneration progresses
affecting the whole length of OC, and the IHC and SGN survival also is reduced in the BCT
and ACT. Due to the results obtained at the tissue level not explain completely those
obtained at the functional level, we performed a suprathreshold analysis of ABR registers.
This analysis allowed us to study the mechanisms involved in the auditory signal processing
once this one is transmitted through the afferent pathway to the auditory nerve. We
determined that in young Kcnq4 -/- mice, the amplitudes of P1, P2, and P5 are reduced for
the middle and high frequencies, revealing alterations in the electric transmission of sound
signals in the middle cochlear turn and the BCT. As a mechanism of compensation before
the cellular degeneration in the OC, we discovered that there is hyperactivity at the central
nervous system level (CNS) for certain sound frequencies. In the middle-aged animals, we
noticed that ABR peak amplitudes are also reduced, but differently respecting young
animals. The amplitude diminishment was detected along the whole cochlea and is
generated by IHC and SGN degeneration and dysfunction. To analyze the auditory
sensitivity in the Kcnq4 -/- cochlea to loud noises, we carried out an experiment of acoustic
trauma. As a result, we discovered that even though the noise exposure triggered OHC
death by apoptosis in the Kcnq4 -/- mice, these events did not generate greater damage than
the existing ones due to the lack of Kv7.4.
The findings presented in this thesis contribute to deciphering the cellular and molecular
events involved in the different phases of deafness caused by Kv7.4 absence. In the early
phase, there is a mild to moderate HL. According to the mechanisms reported in this work,
this phase can be divided into three phases: early, in which occurs hair cell dysfunction due
to its depolarization, PRESTIN mislocalization, and stereocilia alterations; intermediate, in
which apoptosis is activated, and late, where CCEs dye. Finally, in the second phase of HL,
there is a profound deafness caused by IHC and SGN degeneration. Although there are
different animal models carrying human equivalent mutations, these animals did not be able
to explain the advanced HL. The use of Kcnq4 -/- mice allowed us to discover the events
taking part in both phases of DFNA2 and especially in the second one, which were unknown
so far. Additionally, these findings help to understand the mechanisms underlying other
types of HL, which share a similar progression with DFNA2 deafness
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/6372 |
| Date | 30 March 2023 |
| Creators | Carignano, Camila |
| Contributors | Spitzmaul, Guillermo Federico |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Format | application/pdf |
| Rights | 2 |
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