La recirculación del potasio (K+ ) es un proceso indispensable para la audición, que tiene lugar en el órgano de Corti (OC). Ante la presencia de estímulos sonoros, el K+ ingresa a las células ciliadas, despolarizándolas. Luego, este ion es extruido de estas células, atravesando las células de soporte y la stria vascularis, desde donde es secretado nuevamente hacia la endolinfa. La salida de K+ de las células ciliadas externas (CCEs) es llevada a cabo fundamentalmente por el canal Kv7.4. Estos están formados por 4 subunidades iguales codificadas por el gen Kcnq4, que se disponen en forma de anillo y delimitan un poro en el centro a través del cual ocurre el paso selectivo de K + . La sordera DFNA2 es causada por mutaciones en Kv7.4. Esta enfermedad se desarrolla como una pérdida auditiva (PA) neurosensorial de herencia autosómica dominante que progresa con la edad, produciendo una sordera leve a moderada en las etapas iniciales, hasta alcanzar una sordera profunda que comienza alrededor de los 50 años en las frecuencias sonoras altas. En sus comienzos, la PA alcanza hasta 60 dB de intensidad, lo cual correlaciona con un mal funcionamiento de las CCEs. Luego, en la adultez, la sensibilidad auditiva disminuye aún más, indicando que otros mecanismos intervienen en la PA. Hasta el momento, no está claro cuáles son las consecuencias a nivel celular y molecular del mal funcionamiento o de la ausencia de los canales Kv7.4 en las células ciliadas. Además, los modelos animales empleados para el estudio de esta patología no han logrado ser útiles para descubrir los eventos que causan la PA avanzada. En esta tesis, se descifraron nuevos roles funcionales que cumplen los canales Kv7.4 en las CCEs y en el oído interno y se dilucidaron los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la degeneración celular en las dos etapas de la sordera. Como modelo de estudio de la enfermedad, se emplearon ratones de la cepa C3H que carecen de la expresión de los canales Kv7.4 (Kcnq4-/-). El capítulo I se enfocó en el análisis de la degeneración tisular en la cóclea de los animales Kcnq4-/-, cuyo alelo se expresó en la cepa murina C3H/HeJ. En primer lugar, analizamos si la expresión de los canales Kv7.4 en la cóclea de los ratones C3H WT y la funcionalidad del sistema auditivo era similar a la reportada para otras cepas. Mediante inmunofluorescencia (IF) y PCR cuantitativa (qPCR) se encontró que esta proteína se localiza en las CCEs del OC y su expresión es más intensa en el giro coclear basal (GCB). A través de la tecnología de super resolución del microscopio confocal, se pudo determinar que estas proteínas se localizan en la membrana plasmática del polo basal de las CCEs mientras que PRESTINA, la proteína motora de las CCEs, se sitúa en la membrana plasmática lateral. A nivel histológico y funcional, se notó que la cepa C3H conserva las células ciliadas y su función auditiva por lo menos, hasta el año de edad, lo cual permitió utilizarla para evaluar los mecanismos que intervienen en la sordera causada por ausencia de Kv7.4, excluyendo la influencia de la edad. En segundo lugar, se realizó la caracterización espacio-temporal de la supervivencia de las células ciliadas mediante citococleogramas y de las neuronas del ganglio espiral (NGEs) en ratones WT y Kcnq4 -/-. Se detectó que en los animales Kcnq4-/-, las CCEs degeneran progresivamente a lo largo de toda la cóclea, comenzando en el GCB a edades jóvenes, tan pronto como a las 3 semanas de edad (W). También se determinó la velocidad de degeneración de las CCEs en las distintas regiones cocleares. Esta es mucho mayor en el GCB y disminuye hacia el ganglio coclear apical (GCA), en correlación con el gradiente de expresión de Kv7.4. El análisis de supervivencia celular reveló que el número de las CCIs disminuye a partir de las 40 W, al igual que las NGEs. Si bien estas células degeneran 37 W más tarde, su velocidad de desaparición es más acelerada. Además, se evaluó la superficie de ambos tipos de células ciliadas a nivel ultraestructural, mediante microscopía electrónica de barrido. Al emplear esta técnica, se descubrieron diferentes alteraciones en los estereocilios de las mismas que podrían afectar la mecanotransducción y transducción de los sonidos, las principales funciones que realizan las CCEs y las células ciliadas internas (CCIs), respectivamente. Por otro lado, se descubrió que Kv7.4 podría contribuir con la compartimentalización de proteínas como PRESTINA. El capítulo II se centró en el estudio de los mecanismos de muerte celular que conducen a la pérdida de las células ciliadas y de las NGEs, en la estimación de la función auditiva de los ratones Kcnq4-/- de distintas edades y en determinar si la sobreestimulación de su sistema auditivo genera mayores daños en el OC. También se evaluó el efecto de una sobreestimulación del sistema auditivo de estos animales mediante un ensayo de trauma acústico. Empleando la técnica de IF, se analizó la vía autofágica y apoptótica. Como resultado, no se encontró activación de autofagia en la cóclea de los Kcnq4-/- jóvenes ni maduros, pero sí se detectó que la apoptosis es una vía activa en las CCEs a edades tempranas y en las NGEs a edades maduras, lo cual contribuye a explicar la disminución en la supervivencia de estas células. Mediante qPCR, se descubrió que los niveles de expresión del gen proapoptótico Bax se encuentran elevados, mientras que los del gen antiapoptótico Bcl-2 están disminuidos en la cóclea Kcnq4-/-. Este hallazgo permite inferir que la activación de la vía apoptótica intrínseca causa la muerte celular en el OC Kcnq4-/-. Para complementar el análisis histológico y evaluar la función auditiva de nuestro modelo animal Kcnq4-/- se realizaron dos ensayos: uno cualitativo y otro cuantitativo. El primero, consistió en la prueba del reflejo de Preyer, que permite estimar si un animal padece de sordera profunda. A través de este, se notó que a medida que progresa la edad, la cantidad de ratones Kcnq4 -/- que no responden al estímulo sonoro, se incrementa. Estos resultados indican que la sordera es progresiva con la edad en los animales Kcnq4 -/-. Las pruebas auditivas cuantitativas incluyeron el test de respuesta auditiva del tronco cerebral (ABRs) y el de emisiones otoacústicas producto de la distorsión (DPOAEs). Se determinó que la función auditiva de los Kcnq4-/- jóvenes está desmejorada ya que los umbrales auditivos aumentaron 20-40 dB en la región coclear de mayor sensibilidad. Además, el ensayo de DPOAEs mostró un aumento de 20 dB en el umbral. Estos datos indican que en etapas tempranas hay un funcionamiento defectuoso de las CCEs. La audición empeora aún más en los Kcnq4 -/- maduros, que mostraron umbrales auditivos mayores a 80 dB, señalando que estos padecen de sordera profunda, lo cual involucra no sólo un mal funcionamiento de las CCEs, sino también de los componentes de la vía auditiva aferente. A nivel histológico, los Kcnq4 -/- jóvenes únicamente mostraron degeneración de las CCEs en el GCB y defectos en los estereocilios de ambas células ciliadas. Mientras que, en los animales de mayor edad, la degeneración de las CCEs progresa afectando toda la longitud del OC, y la supervivencia de las CCIs y NGEs también disminuye en el GCB y ganglio coclear apical. Debido a que los resultados obtenidos a nivel tisular no lograron explicar completamente los obtenidos a nivel funcional, se realizó un análisis supraumbral de los registros de ABR. Este análisis permitió estudiar los mecanismos que intervienen en el procesamiento de la señal auditiva una vez que esta se transmite por la vía aferente, hacia el nervio auditivo. Se determinó que, a edades jóvenes, los ratones Kcnq4 -/- exhiben una reducción en la amplitud de los picos (P) P1, P2 y P5 para frecuencias medias y altas, lo cual revela alteraciones en la transmisión eléctrica de las señales sonoras en el giro coclear medio (GCM) y GCB. Como mecanismos de compensación ante la degeneración celular que ocurre en el OC, descubrimos que existe una hiperactividad a nivel del sistema nervioso central (SNC) para determinadas frecuencias sonoras. A edades maduras, también hallamos que las amplitudes de los distintos picos de la ABR están reducidas, pero a diferencia de lo notado en animales jóvenes, este decremento ocurre a lo largo de toda la cóclea y es generado por la disfunción y degeneración de las CCIs y NGEs. Para analizar la sensibilidad de la cóclea de los animales Kcnq4-/- frente a ruidos intensos, se llevó a cabo un ensayo de trauma acústico. Como resultado, se descubrió que, si bien la exposición a ruidos provocó degeneración y muerte celular de las CCEs por apoptosis en los ratones Kcnq4-/-, estos eventos no provocaron un daño mayor al ya existente debido a la ausencia de los canales Kv7.4. Los hallazgos presentados en esta tesis contribuyen a descifrar los eventos a nivel celular y molecular que intervienen en las distintas fases de la sordera causada por la ausencia de Kv7.4. En la etapa temprana (juvenil) hay una pérdida auditiva leve a moderada. De acuerdo a los mecanismos que se reportan aquí, esta etapa puede subdividirse en tres fases: una temprana, en la que ocurre la disfunción de las células ciliadas debido a despolarización, deslocalización de PRESTINA en las CCEs, y alteraciones en el haz de estereocilios; una intermedia, en la que se activa la vía apoptótica y una tardía, donde tiene lugar la muerte de las CCEs. Finalmente, en la segunda etapa de la PA, hay una sordera profunda producida por la degeneración de las CCIs y NGEs. Si bien existen modelos animales que portan mutaciones equivalentes a las encontradas en humanos, estos no han logrado explicar la PA avanzada. El empleo del ratón Kcnq4-/- nos ha permitido descubrir los eventos que tendrían lugar en ambas fases de la PA, y especialmente, en la segunda, los cuales eran desconocidos hasta el momento. Adicionalmente, estos resultados ayudan a comprender los eventos que subyacen otros tipos de PA que comparten una progresión similar a la sordera DFNA2 / Potassium (K+ ) recirculation is an indispensable process for the audition, which takes place in the organ of Corti (OC). In the presence of auditory stimuli, K+ enters the hair cells, depolarizing them. Then, this ion is extruded out from these cells, moving through the supporting cells and the stria vascularis, from where it is secreted again to the endolymph. K+ exit from the outer hair cells (OHCs) is carried out mainly by Kv7.4 channels. These proteins are formed by four equal subunits, which are codified by the Kcnq4 gene, and are arranged in a ring shape, delimiting a pore in the center through which occurs the selective entrance of K+ . DFNA2 deafness is caused by Kv7.4 mutations. This disease develops as a neurosensorial hearing loss (HL) and it inherits as an autosomal dominant disorder, which is progressive through age. It produces a mild to moderate HL in the initial stage until it reaches profound deafness which starts around 50-year-old in the high frequencies. In the beginning, HL reaches an intensity of 60 dB, which correlates with the inappropriate functioning of OHCs. Then, in adulthood, auditory sensitivity reduces, even more, indicating that other mechanisms develop in HL. So far, it is not clear which are the consequences at the cellular and molecular level of the malfunctioning or absence of the Kv7.4 channels in the hair cells. Additionally, the animal models used for the study of this pathology, are not useful to discover the events causing advanced HL. In this thesis, we deciphered new functional roles of Kv7.4 channels in the OHCs and the inner ear and we elucidated the molecular and cellular mechanisms underlying cell degeneration in the two phases of deafness. As an animal model for this disease, we use C3H mice lacking Kv7.4 expression (Kcnq4 -/-). Chapter I focused on the analysis of tissue degeneration in the cochlea of Kcnq4-/- animals, whose allele was expressed in the C3H/HeJ mouse strain. First, we studied if Kv7.4 channel expression in the WT mice and the auditory system function were similar to those reported in other strains. By using immunofluorescence (IF) and quantitative PCR (qPCR) we found that this protein is localized in the OHCs of the OC and its expression is more intense in the basal cochlear turn (BCT). Through the super-resolution technology of the confocal microscope, we determined that these proteins are localized in the plasma membrane of the OHC basal pole, while PRESTIN is situated in the lateral plasma membrane. At the functional and histological level, we discovered that the C3H strain preserves the hair cells and its auditory sensitivity for at least, to one-year-old. This allowed us its use to evaluate the mechanisms participating in the HL caused by Kv7.4 absence, excluding the age factor. Then, we performed the spatio-temporal characterization of the hair cell survival by cytococleograms. and of the spiral ganglion neuron (SGN) survival in WT and Kcnq4 -/- mice. We detected that in young Kcnq4-/- mice, OHCs degenerate progressively along the cochlea, starting at the BCT, as soon as 3-week-old (W). Moreover, we determined the speed of CCE degeneration in the different cochlear regions. This is greater in the BCT and it reduces towards the apical cochlear turn (ACT), correlating with the Kv7.4 gradient expression. The survival analysis revealed that the IHC number reduces from 40 W, in the same way as SGNs. Even though these cells degenerate 37 W later, their velocity of death is more accelerated. Moreover, we investigated the surface of both types of hair cells at the ultrastructural level, by scanning electron microscopy. By using this technique, we discovered different alterations in the hair cell stereocilia, which could affect the mechanotransduction and sound transduction, the main functions of these cells, respectively. On the other hand, we found that Kv7.4 channels may contribute to PRESTIN compartmentalization given that their absence produces its mislocalization. Chapter II focused on the study of the cellular death mechanisms leading to the loss of hair cells and SGNs; on the auditory function estimation of Kcnq4 -/- mice at different time points, and on determining if auditory overstimulation produces more damage in the OC. By IF, we analyzed the autophagic and apoptotic pathways. As a result, we did not find autophagy activation in Kcnq4-/- cochlea from young and middle-aged mice. However, we detected apoptosis activation in the OHCs from young mice and in the SGNs from middle- aged animals, which contributes to explaining their reduced survival. By qPCR, we discovered that the expression levels of the proapoptotic gene Bax are elevated, while those of the antiapoptotic gene Bcl-2 are reduced in the Kcnq4-/- cochlea. These findings allowed us to infer that the activation of the intrinsic apoptotic pathway causes cellular death in the Kcnq4-/- OC. To complement the histological analysis and to evaluate the auditory function in our animal model, we used two tests, one qualitative and the other quantitative. The first one consisted of Preyer’s reflex test, which allowed us to estimate if an animal suffers from profound HL. Through this, we found that as age progresses, the amount of Kcnq4 -/- mice that do not respond to the stimulus, increases. These results indicate that HL is progressive with age in the Kcnq4 -/- animals. The quantitative auditory tests include the auditory brainstem response (ABR) and the distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). By using these tests, we discovered that auditory sensitivity is impaired in the young Kcnq4 -/- mice given that auditory thresholds elevate 20-40 dB in the most sensitive cochlear region. This data indicates that since young ages there is an altered function of CCEs. The audition impairs even more in the middle-aged mice, which showed auditory thresholds greater than 80 dB, indicating that these animals suffer from profound deafness. This involves not only the malfunction of OHCs but also of the afferent auditory pathway components. At the histological level, young Kcnq4-/- mice showed OHC degeneration in the BCT and stereocilia defects in both types of hair cells. While in the older animals, OHC degeneration progresses affecting the whole length of OC, and the IHC and SGN survival also is reduced in the BCT and ACT. Due to the results obtained at the tissue level not explain completely those obtained at the functional level, we performed a suprathreshold analysis of ABR registers. This analysis allowed us to study the mechanisms involved in the auditory signal processing once this one is transmitted through the afferent pathway to the auditory nerve. We determined that in young Kcnq4 -/- mice, the amplitudes of P1, P2, and P5 are reduced for the middle and high frequencies, revealing alterations in the electric transmission of sound signals in the middle cochlear turn and the BCT. As a mechanism of compensation before the cellular degeneration in the OC, we discovered that there is hyperactivity at the central nervous system level (CNS) for certain sound frequencies. In the middle-aged animals, we noticed that ABR peak amplitudes are also reduced, but differently respecting young animals. The amplitude diminishment was detected along the whole cochlea and is generated by IHC and SGN degeneration and dysfunction. To analyze the auditory sensitivity in the Kcnq4 -/- cochlea to loud noises, we carried out an experiment of acoustic trauma. As a result, we discovered that even though the noise exposure triggered OHC death by apoptosis in the Kcnq4 -/- mice, these events did not generate greater damage than the existing ones due to the lack of Kv7.4. The findings presented in this thesis contribute to deciphering the cellular and molecular events involved in the different phases of deafness caused by Kv7.4 absence. In the early phase, there is a mild to moderate HL. According to the mechanisms reported in this work, this phase can be divided into three phases: early, in which occurs hair cell dysfunction due to its depolarization, PRESTIN mislocalization, and stereocilia alterations; intermediate, in which apoptosis is activated, and late, where CCEs dye. Finally, in the second phase of HL, there is a profound deafness caused by IHC and SGN degeneration. Although there are different animal models carrying human equivalent mutations, these animals did not be able to explain the advanced HL. The use of Kcnq4 -/- mice allowed us to discover the events taking part in both phases of DFNA2 and especially in the second one, which were unknown so far. Additionally, these findings help to understand the mechanisms underlying other types of HL, which share a similar progression with DFNA2 deafness

Degeneration and age affect the biomechanics of the intervertebral disc, by reducing its stiffness, flexibility and shock absorption capacities against daily movement and spinal load. The biomechanical characterization of intervertebral discs is achieved by conducting mechanical testing to vertebra-disc-vertebra segments and applying axial, shear, bend and torsion loads, statically or dynamically, with load magnitudes corresponding to the physiological range. However, traditional testing does not give a view of the load and deformation states of the disc components: nucleus pulposus, annulus fibrosus and endplate. Thus, the internal state of stress and strains of the disc can only be predicted by numerical methods, one of which is the finite element method. The objective of this thesis was, to study the biomechanics of degenerated intervertebral discs to load conditions in compression, bending and torsion, by using mechanical testing and a finite element model of disc degeneration, based on magnetic resonance imaging (MRI). Therefore, lumbar discs obtained from cadavers corresponding to spinal levels L2-L3 and L4-L5 with mild to severe degeneration were used. Intervertebral osteochondrosis and spondylosis deformans were identified, being the disc space collapse, the most striking feature. Next, all discs were tested to static and dynamic load conditions, the results gained corresponded to the disc stiffness (in compression, bending and torsion), stress relaxation and dynamic response. Of these, the stiffness response was used to validate the disc model. The testing results suggest that discs with advanced degeneration over discs with mild degeneration are, less rigid in compression, less stiffer under bending and torsion, showed less radial bulge, and reduce their viscoelastic and damping properties. This study shows that degeneration has an impact on the disc biomechanical properties which can jeopardize normal functionality. Development of one finite element model of disc degeneration started by choosing a MRI of a L2-L3 disc. Segmentation of vertebra bone and disc materials followed, and were based on pixel brightness and radiology fundamentals, then a finite element mesh was created to account for the disc irregular shape. The disc materials were modeled as hyperelastic and the bone materials were modeled as orthotropic and isotropic. Adjustment of material properties was based on integrity of the annulus fibrosus, giving a stiffness value matching that of a mild degeneration disc. Then, validation of the model was performed, and included a study of the distributions of stress and strain under loads of compression, bending and torsion. The results from all load simulations show that the disc undergoes large deformations. In contrast, the vertebrae are subjected to higher stress but with negligible deformations. In compression, the model predicted formation of symmetrical disc bulge which agree with the testing behavior. The nucleus pulposus showed to be the principal load carrier with negative principal stresses and strains. In bending and torsion, the annulus fibrosus showed to be the principal load carrier with large symmetrical principal strains and stresses for the former loading and large shearing for the latter. The study showed the importance of soft tissue deformation, mostly noticed in advanced degeneration. In contrast, the higher stresses in the vertebra over those of the intervertebral disc showed the relevance of bone predisposition to fracture. Such kind of studies, should contribute to the understanding of the biomechanics of the intervertebral disc. / La degeneración y edad afectan la biomecánica del disco intervertebral, reduciendo la capacidad de rigidez, flexibilidad y atenuación de impactos, contra el movimiento y carga del raquis. La caracterización biomecánica del disco se realiza con ensayos mecánicos a segmentos de vértebra-disco-vértebra y aplicando cargas axiales, cortantes, flexión y torsión, estáticas ó dinámicas, con magnitudes de carga según el intervalo fisiológico. Sin embargo, las pruebas tradicionales no dan una visión de los estados de carga y deformación de los componentes del disco: núcleo pulposo, anillo fibroso y placa terminal. Por lo tanto, el estado interno de esfuerzos y deformaciones del disco, solo puede ser predicho con métodos numéricos, uno de los cuales es el método de elemento finito. El objetivo de esta tesis fue, estudiar la biomecánica de discos intervertebrales degenerados a las condiciones de carga en compresión, flexión y torsión, mediante el uso de ensayos mecánicos y de un modelo de elementos finitos de la degeneración de disco, basado en imágenes con resonancia magnética (MRI). Por lo tanto, se usaron discos lumbares L2-L3 y L4-L5 obtenidos de cadáveres, con degeneración leve a severa. Se identificó osteocondrosis intervertebral y espondilosis deformante, siendo el colapso del espacio intervertebral el aspecto más relevante. Luego, todos los discos fueron ensayados a condiciones de carga estática y dinámica, y los resultados correspondieron a la rigidez del disco (a compresión, flexión y torsión), a la relajación de tensiones y a la respuesta dinámica. De éstos, la rigidez fue usada para validar el modelo de disco. Los resultados de los ensayos sugieren que los discos con degeneración avanzada sobre aquellos con degeneración leve son, menos rigidos a compresión, menos rigidos a flexión y torsión, presentan menor protuberancia radial, y reducen sus propiedades viscoelásticas y de amortiguamiento. El estudio muestra que la degeneración impacta las propiedades biomecánicas del disco, poniendo en riesgo la funcionalidad normal. El desarollo de un modelo de elementos finitos de la degeneración de disco inició eligiendo una secuencia de resonancia magnética de un disco L2-L3. La segmentación de los materiales del disco y de las vértebras se realizó basado en intensidad de brillo del pixel y en fundamentos de radiología, y se creó una malla de elementos finitos correspondiente a la forma irregular del disco. Los materiales del disco se modelaron como hiperelásticos y los tejidos óseos se modelaron como materiales ortotrópicos e isotrópicos. El ajuste de propiedades de los materiales fue basado en la integridad del anillo fibroso, y dio una rigidez correspondiente a la de un disco con degeneración leve. Luego, se realizó la validación del modelo, e incluyó un estudio de las distribuciones de esfuerzo y deformación a las condiciones de carga en compresión, flexión y torsión. Los resultados de todas las simulaciones de carga mostraron que el disco es sometido a grandes deformaciones. En contraste, las vértebras fueron sometidas a mayores esfuerzos pero con deformaciones insignificantes. En compresión, el modelo predijo la formación de una protuberancia radial simétrica, en concordancia con la experimentación. El núcleo pulposo mostró ser el portador principal de carga, con tensiones y deformaciones principales negativas. En flexión y torsión, el anillo fibroso mostró ser el portador principal de carga, con grandes deformaciones y tensiones principales simétricas para la primera carga, y con grandes tensiones cortantes para la segunda carga. El estudio mostró la importancia de las deformaciones de los tejidos blandos, principalmente notados en la degeneración avanzada. Por el contrario, las tensiones mayores en los cuerpos vertebrales sobre aquellas del disco intervertebral mostraron la relevancia de la predisposición a las fracturas óseas. Este tipo de estudio debe contribuir a la comprensión de la biomecánica del disco intervertebral.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la utilidad de la secuencia selectiva de rótula en RM para el diagnóstico de condromalacia rotuliana en comparación con la secuencia convencional. El estudio es de diseño cuantitativo, observacional, descriptivo, transversal y retrospectivo. Lugar de investigación: Clínica Internacional, sede docente. Se utiliza las historias clínicas e imágenes archivadas en el sistema PACS de los pacientes con diagnóstico presuntivo de condromalacia rotuliana durante el periodo de febrero 2014 - mayo del 2015. La muestra es dividida en dos grupos. El primer y segundo grupo, es 35 historias clínicas e imágenes de pacientes sometidos a la secuencia convencional y la secuencia selectiva en un protocolo de RM de rodilla, respectivamente. Usando el formato de recolección de datos se obtiene la información que luego es dirigida y procesada por el programa estadístico SPSS. Se utiliza la prueba no paramétrica de Mann Witney y el modelo lineal generalizado de Poisson. Los resultados demuestran que la secuencia selectiva presenta un número promedio de hallazgos significativamente mayor, comparado con la secuencia convencional. Concluye que la realización de la secuencia selectiva de rotula en pacientes con diagnostico presuntivo de condromalacia rotuliana permite una adecuada caracterización de las lesiones del cartílago articular y un mayor número de hallazgos radiológicos. / Tesis

Las enfermedades ectásicas de la córnea o ectasias corneales son un grupo de condiciones caracterizadas por el adelgazamiento y deformación progresiva de la córnea. Se dividen en varios tipos y estadíos atendiendo a sus características y propiedades. Su detección precoz y su diagnóstico diferencial son aspectos fundamentales que permiten un adecuado manejo clínico y/o tratamiento desde su etapa más incipiente. Asimismo, resulta crucial entender el curso natural de cada condición y disponer de criterios que permitan evaluar el grado de progresión de las mismas. Se ha visto que los sistemas e indicadores diagnósticos actuales para la detección del queratocono, de la degeneración marginal pelúcida y especialmanete del queratocono subclínico presentan limitaciones, por lo que en la presente tesis se ha analizado la capacidad diagnóstica de nuevos índices para la detección de dichas afecciones. Dentro de estos nuevos índices, se encuentran los parámetros vectoriales ORA, TD y CorT, así como los parámetros asociados al perfil geométrico corneoescleral. Se ha obtenido una diferente distribución de todos los parámetros vectoriales y de varios parámetros esclero-conjuntivales entre ojos sanos y ojos con queratocono, aunque únicamente el ORA y el TD mostraron una precisión diagnóstica apropiada. Asimismo, estos dos parámetros fueron los únicos que presentaron diferencias significativas entre ojos sanos y ojos con queratocono subclínico, obteniendo una capacidad diagnóstica similar e incluso superior a parámetros clínicos empleados en la práctica clínica habitual para la detección de dicha condición. Se ha desarrollado un modelo de detección del queratocono subclínico a partir de la combinación de parámetros clínicos, el cual muestra una precisión diagnóstica superior a la ofrecida por muchos de los algoritmos actuales. En cuanto a la valoración de la evolución y progresión de las ectasias corneales, se ha puesto de manifiesto la ausencia de criterios científicamente avalados para tal fin, por lo que en la presente tesis se han evaluado los cambios ópticos y geométricos producidos a largo plazo en el queratocono y se han determinado las variables que presentan una mayor variación y que, por tanto, parecen ser las más adecuadas para evaluar y determinar la progresión o avance del queratocono. Asimismo, se ha desarrollado un índice multiparamétrico para predecir la progresión futura del queratocono, el cual requiere un refinamiento para poder ser incorporado en la práctica clínica.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el potencial neuroprotector de los péptidos obtenidos mediante hidrólisis enzimática de forma secuencial de la proteína soluble aislada de las semillas de tarwi. Las semillas fueron sometidas a un proceso de deslupinizado para la eliminación de alcaloides y a un proceso de deslipidizado con etanol previo a la obtención del concentrado proteico el cual incrementó su contenido proteico hasta 76.74% y que fueron hidrolizadas utilizando de forma secuencial las enzimas pepsina 0,7 FIP (Federación Internacional de Farmacia)- U/mg (HP), pancreatina 350 FIP- U/g (HPP) y Alcalasa 2,4 U/g proteína (HPPA), durante 30, 60 y 138 min, respectivamente. El HPPA presentó un buen grado de hidrólisis (46.12 ± 2.77%), y se separó en tres fracciones peptídicas UF1, UF2 y UF3 de tamaños, > a 10 kDa, 3-10 kDa y < a 3 kDa, respectivamente. La UF3 presentó mayor actividad antioxidante con valores de 5.34 ± 0.45 y 7.62 µmol ET / mg proteína según los métodos ABTS y ORAC, respectivamente y una actividad quelante de Fe +2 de 96.39 ± 2.56% con 5 µg de proteína. Para evaluar el potencial neuroprotector de las fracciones se utilizó un modelo celular de peroxidación lipídica inducida con sulfato ferroso en tejido cerebral de ratón. La UF3 fue capaz de inhibir la peroxidación lipídica en 40.52 ± 1.13% a una concentración de 0.0125 mg/mL (p <0.05). Por tanto, la fracción menor a 3 kDa obtenida se podría utilizar como ingrediente de alimentos funcionales con potencial en la prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. / Tesis

Friedreich ataxia (FRDA) is a recessive human disease of central and peripheral nervous system that affects children and young adults. FRDA is a peripheral neuropathy characterized by a initial degeneration of the large neurons of the dorsal root ganglia (DRG) or proprioceptive neurons. Most of the patients with FRDA have a homozygous guanine-adenine-adenine (GAA) expansion within the first intron of the gen that codifies for a small mitochondrial protein, frataxin (FXN). This mutation leads to a reduction of frataxin expression in all human cells, which produces changes in both the cell and mitochondrial physiology, resulting in a dysfunction of the mitochondrial energetic metabolism linked to the increase of oxidative stress and calcium dyshomeostasis. These cellular proceses are tightly related with the regulation of the actin and microtubule cytoskeletons and with vesicle trafficking. Here, we show how the absence of frataxin in the mouse models YG8R and YG8sR affects the axonal cytoskeleton of adult sensory neurons. Changes of actin and microtubule cytoskeletons and the failure of Ca 2+ signaling induce alterations of dynamics growth cones of sensory neurons, which in turn produce a reduction of their capacity to grow and regenerate their axons. This study shows how these events can lead to the neurodegeneration in Friedreich's ataxia. / La Ataxia de Friedreich (FRDA) es una enfermedad autosómica recesiva del sistema nervioso central y periférico que afecta a niños y adultos jóvenes. Esta neuropatía sensitiva está caracterizada por una degeneración primaria de las neuronas sensitivas largas del ganglio dorsal (DRG). En la mayoría de los pacientes con FRDA, la mutación consiste en una expansión homocigota del trinucleótido guanina-adenina-adenina (GAA) en el intrón 1 del gen que codifica para una proteína mitocondrial, la frataxina (FXN). La consecuencia de la mutación es la deficiencia de la frataxina, lo cual condiciona cambios en la fisiología mitocondrial y celular, teniendo como resultado una disfunción del metabolismo energético mitocondrial asociado con el incremento del estrés oxidativo en la célula y a una alteración de la homeostasis del calcio. Estos procesos están estrechamente relacionados con la regulación del citoesqueleto de actina, microtúbulos, y con el tráfico de vesículas. En este trabajo de tesis se demuestra cómo la estabilidad del citoesqueleto axonal de las neuronas sensitivas de dos modelos murinos YG8R e YG8sR están afectados debido a la falta de frataxina. Cambios en el citoesqueleto de actina y microtúbulos, unido al fallo en la señalización por Ca 2+ provocan una alteración en la dinámica de la forma del cono de crecimiento, disminuyendo el crecimiento y la regeneración axonal y afectando a la guía axonal en las neuronas sensitivas adultas. Este estudio muestra cómo estos eventos conducen a la neurodegeneración en la ataxia de Friedreich. / L'Ataxia de Friedreich (FRDA) és una malaltia autosómica recessiva del sistema nerviós central i perifèric que afecta a xiquets i adults joves. Aquesta neuropatia sensitiva ve caracteritzada per una degeneració primaria de les neurones sensitives llargues del gangli dorsal (DRG). En la majoria dels pacientes de FRDA la mutació consisteix en una expansió homozigòtica del trinucleòtid guanina-adenina-adenina (GAA) en l'intró 1 del gen que codifica per a la proteïna mitocondrial frataxina (FXN). La conseqüència d'aquesta mutació és la deficiencia de frataxina, aquest fet condiciona canvis en la fisiologia mitocondrial i cel.lular, tenint com a resultat una disfunció del metabolisme energètic mitocondrial associat a l'increment de l'estrés oxidatiu en la cèl.lula i una alteració de la homeòstasi del calci. Aquestos processos estàn íntimament relacionats amb la regulació del citoesquelet d'actina, microtúbuls i el tràfic de vesícules. En aquest treball de tesi doctoral es mostra com l'estabilitat del citoesquelet axonal de les neurones sensitives de dos models murins YG8R i YG8sR es troben afectats a causa de la deficiencia de frataxina. Canvis en el citoesquelet d'actina i microtúbuls, juntament a la fallida en la senyalitzación per Ca2+ provoquen una alteració en la dinámica de la forma del con de creixement, disminuint-lo junt amb la regeneració axonal i afectat la guia axonal en les neurones sensitives adultes. Aquest estudi posa de manifest com aquestos events condueixen a la neurodegeneració en la ataxia de Friedreich. / Muñoz Lasso, DC. (2017). Fisiopatología de la ataxia de Friedreich: Transporte y degeneración axonal [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/92842

[EN] Over the last 20 years health system has been revolutionized by imaging technology so diagnostic imaging has become the mainstay of the management of patients. Nowadays, degeneration of the intervertebral discs, herniation and spinal stenosis are very common entities that affect millions of people and cause back pain. The development of computer-aided diagnosis (CAD) methods for classifying and quantifying these pathologies has increased in the past decade as a way to assist radiologists in the diagnosis task. So, the main objective of the first part of this Doctoral Thesis is the development of a CAD software for the classification and quantification of spine disease by means of Magnetic Resonance image analysis. To this end, two different groups of patients have been used, one as training group (14 patients) and the other as testing group (53 patients). To classify disc degeneration according to the gold standard, Pfirrmann classification, a method mainly based on the measurement of disc signal intensity and structure has been developed. The method developed to detect disc herniations has been focused on disc segmentation and its approximation by an ellipse, in this way it is possible to extract disc shape features for detecting contour abnormalities. The method developed to detect spinal stenosis, based on signal intensity, has been developed to extract the spinal canal and, by applying different techniques, to detect spinal stenosis at every intervertebral disc level and quantify the severity of the pathology. The results have shown a segmentation inaccuracy below 1%. Regarding reproducibility, it has been obtained an almost perfect agreement (measured by the k and ICC statistics) for all the analysed pathologies. The results have shown that the developed methods can assist radiologists to perform their decision-making tasks, providing support for enhanced reproducibility of MRI reports and achieving greater objectivity. However, not only the intervertebral discs are susceptible to suffer several pathologies. The vertebral bodies are also subject to a wide variety of diseases because of different circumstances. So, prior to any diagnosis task, an accurate detection and segmentation of the vertebral bodies are the first crucial steps. Therefore, the main objective of the second part of this Doctoral Thesis is the development of an automatic method for the detection and segmentation of the spine in Computed Tomography imaging. Performing an automatic and robust segmentation is a very challenging task due to the difficulty discriminating between the ribs and the vertebral bodies. To overcome this problem, two different segmentation methods have been combined: the first method uses a Level-Set method to perform an initial segmentation; the second method uses a probabilistic atlas to refine the initial segmentation with a special focus on ribs suppression. So a 3D volume indicating the probability of each voxel of belonging to the spine has been developed, by means of a set of images, corresponding to 14 patients (training group), manually segmented by an expert. The generated probability map has been deformed and adapted to each testing case. To evaluate the segmentation results and the improvement obtained after applying the atlas to the initial segmentation, the Dice similarity coefficient (DSC) and the Hausdorff distance (HD) have been used. The results have shown up an average of 11 mm of improvement in segmentation accuracy in terms of HD, obtaining an overall final average of 14,98 ± 1,32 mm. A refinement of 1,3 % has been obtained in terms of DSC, with a global value of 91,75 ± 1,20 %. The study has demonstrated that the atlas is able to detect and appropriately eliminate the ribs while improving the segmentation accuracy. / [ES] En los últimos 20 años el sistema sanitario se ha visto revolucionado por la tecnología de la imagen, por lo que el diagnóstico por imagen se ha convertido en un pilar fundamental en el manejo de los pacientes. Hoy en día la degeneración de los discos intervertebrales, la hernia discal y la estenosis del canal vertebral, son tres patologías que afectan a millones de personas y causan dolor de espalda. El desarrollo de sistemas CAD para clasificar y cuantificar estas patologías se ha incrementado en la última década como una forma de ayuda al radiólogo en el diagnóstico. Por tanto, la primera parte de esta Tesis Doctoral tiene como objetivo el desarrollo de un sistema CAD para la clasificación y cuantificación de la patología discal por medio del análisis de Imagen por Resonancia Magnética. Con este fin se han utilizado dos grupos de pacientes, uno como grupo de entrenamiento (14 pacientes) y el otro como grupo de prueba (53 pacientes). Para la clasificación de la degeneración discal se ha desarrollado un método basado en el cálculo de la estructura del disco y de su señal de intensidad. El método de detección de herniaciones se ha centrado en la segmentación del disco y su aproximación por una elipse, para extraer así información sobre la forma del disco. El método de detección de estenosis, basado en la señal de intensidad, ha sido desarrollado para extraer el canal vertebral y, con la aplicación de diferentes técnicas, detectar estrechamientos a la altura de los discos y cuantificar la gravedad de los mismos. Los resultados han demostrado una alta precisión en la segmentación, con un error inferior al 1 %. En cuanto a la reproducibilidad, se ha obtenido un acuerdo casi perfecto (medido con los coeficientes CCI y k) para todas las patologías analizadas. Los resultados obtenidos demuestran que los métodos desarrollados pueden servir de ayuda al radiólogo en el diagnóstico, mejorando la reproducibilidad y logrando una mayor objetividad. Sin embargo, no sólo los discos intervertebrales son susceptibles de sufrir alguna patología. Los cuerpos vertebrales también pueden sufrir lesiones por diversas circunstancias. No obstante, antes de realizar cualquier tarea de diagnóstico, llevar a cabo una detección y segmentación precisa de los cuerpos vertebrales es un primer paso crucial. Así pues, la segunda parte de esta Tesis Doctoral tiene como objetivo el desarrollo de un método automático para la detección y segmentación de la columna vertebral por medio del análisis de Tomografía Computarizada. Llevar a cabo una segmentación automática y precisa es una tarea complicada debido principalmente a la gran dificultad para distinguir entre los cuerpos vertebrales y las costillas. Para solucionar este problema se han combinado dos métodos de segmentación diferentes: el primero utiliza un método Level-Set para llevar a cabo una segmentación inicial; el segundo utiliza un atlas probabilístico, para refinar la segmentación inicial, con un enfoque especial en la supresión de las costillas. Por tanto, se ha obtenido un volumen 3D indicando la probabilidad de cada voxel de pertenecer o no a la columna vertebral, por medio de un conjunto de imágenes correspondientes a 14 pacientes segmentadas manualmente por un experto. El mapa de probabilidad generado ha sido deformado y adaptado a cada uno de los 7 pacientes del grupo de prueba. Para evaluar los resultados de la segmentación y la mejora obtenida después de aplicar el atlas a la segmentación inicial, se ha utilizado el coeficiente Dice (DSC) y la distancia Hausdorff (HD). Los resultados han demostrado una mejora en la precisión de la segmentación de 11 mm de media en términos de HD, con una media global de 14,98 ± 1,32 mm. En términos de DSC se ha obtenido una mejora de un 1,3 % , con una media global de 91,75 ± 1,20 %. El estudio ha demostrado que el atlas es capaz de detectar y eliminar apropiadamente las estructuras costales / [CA] En els últims 20 anys el sistema sanitari s'ha vist revolucionat per la tecnologia de la imatge, per la qual cosa el diagnòstic per imatge s'ha convertit en un pilar fonamental en el maneig dels pacients. Hui en dia la degeneració dels discos intervertebrals, l'hèrnia discal i l'estenosi del canal vertebral, són tres patologies molt comunes que afecten milions de persones i causen dolor d'esquena. El desenvolupament de sistemes CAD per a classificar i quantificar estes patologies s'ha incrementat en l'última dècada com una forma d'ajuda al radiòleg en el diagnòstic. Per tant, la primera part d'aquesta Tesi Doctoral té com a objectiu el desenvolupament d'un sistema CAD per a la classificació i quantificació de la patologia discal per mitjà de l'anàlisi d'Imatge per Ressonància Magnètica. Amb aquest fi s'han utilitzat dos grups de pacients distints, un com a grup d'entrenament (14 pacients) i l'altre com a grup de prova (53 pacients). Per a la classificació de la degeneració discal, s'ha desenvolupat un mètode basat en el càlcul de l'estructura del disc i del seu senyal d'intensitat. El mètode de detecció d'herniacions s'ha centrat en la segmentació del disc i la seua aproximació per una el·lipse, per a extraure així informació sobre la forma del disc. El mètode de detecció d'estenosi, basat en el senyal d'intensitat, ha sigut desenvolupat per a extraure el canal vertebral i amb l'aplicació de diferents tècniques detectar estrenyiments a l'altura dels discos i quantificar la gravetat dels mateixos. Els resultats han demostrat una alta precisió en la segmentació, amb un error inferior a l'1 %. En quant a la reproduïbilitat, s'ha obtingut un acord quasi perfecte (mesurat amb els coeficients CCI i k) per a totes les patologies analitzades. Els resultats obtinguts demostren que els mètodes desenvolupats poden servir d'ajuda al radiòleg en el diagnòstic, millorant la reproduïbilitat i aconseguint una major objectivitat. No obstant això, no sols els discos intervertebrals són susceptibles de patir alguna patologia. Els cossos vertebrals també poden patir lesions per diverses circumstàncies. Per tant, abans de realitzar qualsevol tasca de diagnòstic, dur a terme una detecció i segmentació precisa dels cossos vertebrals és un primer pas crucial. Així, doncs, la segona part d'aquesta Tesi Doctoral té com a objectiu el desenvolupament d'un mètode automàtic per a la detecció i segmentació de la columna vertebral per mitjà de l'anàlisi de Tomografia Computada. Dur a terme una segmentació automàtica i precisa és una tasca complicada degut principalment a la gran dificultat per a distingir entre els cossos vertebrals i les costelles. Per a solucionar aquest problema s'han combinat dos mètodes de segmentació diferents: el primer utilitza un mètode Level-Set per a dur a terme una segmentació inicial; el segon utilitza un atles probabilístic, per a refinar la segmentació inicial amb un enfocament especial en la supressió de les costelles. Per tant, s'ha obtingut un volum 3D indicant la probabilitat de cada voxel de pertànyer o no a la columna vertebral, per mitjà d'un conjunt d'imatges corresponents a 14 pacients (grup d'entrenament) segmentades manualment per un expert. El mapa de probabilitat generat ha sigut deformat i adaptat a cadascun dels 7 pacients del grup de prova. Per a avaluar els resultats de la segmentació i la millora obtinguda després d'aplicar l'atles a la segmentació inicial, s'ha utilitzat el coeficient Dice (DSC) i la distància Hausdorff (HD). Els resultats han demostrat una millora en la precisió de la segmentació d'11 mm de mitja en termes de HD, amb una mitja global de 14,98 ± 1,32 mm. S'ha obtingut una millora d'un 1,3 % en termes de DSC, amb una mitja global de 91,75 ± 1,20 %. L'estudi ha demostrat que l'atles és capaç de detectar i eliminar apropiadament les estructures costals alhora que millora la precisió de la segmentació. / Ruiz España, S. (2016). CARACTERIZACIÓN CUANTITATIVA DE LA PATOLOGÍA DISCAL Y LUMBAR DEGENERATIVA MEDIANTE ANÁLISIS DE IMAGEN POR RESONANCIA MAGNÉTICA Y DETECCIÓN Y SEGMENTACIÓN DE LA COLUMNA VERTEBRAL EN PACIENTES ONCOLÓGICOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE IMAGEN EN TOMOGRAFÍA COMPUTARIZADA [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/68485

Las enfermedades neurodegenerativas cursan con la degeneración y muerte de las neuronas las cuales son incapaces de suplir su propia muerte. Debido a esta característica enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson o el Glaucoma no tienen cura en la actualidad. La retina es una proyección del sistema nervioso central (SNC) encapsulada en el globo ocular y aislada del resto del SNC, lo que la hace fácilmente accesible a la manipulación experimental. En este trabajo estudiamos las alteraciones funcionales de la retina con el electrorretinograma de campo completo (ERG), técnica basada en el registro de la respuesta eléctrica retiniana tras la presentación de un estímulo de luz homogéneo. Así hemos estudiado los efectos de la sección del nervio, del aumento de presión intraocular y de la fototoxicidad, dichas lesiones afectan selectivamente a determinadas poblaciones neuronales retinianas e imitan enfermedades neurodegenerativas como el Glaucoma o la Degeneración Macular Asociada a la Edad. / Neurodegenerative diseases are characterized by degeneration and death of neurons which are unable to recover after a given insult, thus impairing functional recuperation. Because of this, there is no cure for diseases such as Alzheimer, Parkinson or Glaucoma. The retina is a projection of the central nervous system (CNS) located in the eye and therefore, isolated from the rest of the CNS. This makes the retina a very good model for experimental manipulation. In this work we have studied the functional changes in the retina by full field electroretinograme (ERG). This technique records the electric response of the retina after presentation of homogeneous light stimuli. We have studied the effects that optic nerve sections, increase of the intraocular pressure and phototoxicity have on ERG recordings. These lesions impair selectively certain retinal neuronal populations and imitate neurodegenerative diseases as Glaucoma or Age-related Macular Degeneration.