A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas. / Chagas disease is a zoonosis caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. An estimated 8 million people are infected with T. cruzi worldwide, mostly in Latin America. Traditional diagnostic tests are gradually being replaced by more innovative methods, such as rapid tests and Real Time PCR. The use of recombinant antigens in serology or rapid tests has been proposed in the 90s, and several combinations were tested with sera from patients with different clinical forms in different regions in Latin America. Despite the gain in specificity, these tests showed lower sensitivity, frustrating expectations. This study aims to analyze the genetic variability of KMP11 and 1F8 genes coding for antigens commonly used in such experimental diagnostic. T. cruzi strains belonging to different taxonomic sub-groups and different regions were analyzed in order to assess the impact of antigenic variation in diagnostic tests. Maximizing sensitivity and avoiding cross-reactive epitopes for other pathogens should allow for the design of better rapid tests. In a first step, genomic DNA was extracted from the following strains: DM28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 and CL Brener and we performed amplification of the 1F8 and KMP11 antigen encoding genes from these strains. Gene fragments were cloned, sequenced, and subcloned in expression vectors, followed by detection of the recombinant antigens. Using structural prediction and modeling, secondary and tertiary structures were analyzed the latter only for the 1F8 antigen, to visualize the differences in the amino acid sequences revealed from DNA sequencing. The results presented in this study show that the KMP11 T. cruzi antigen, has a very high similarity in amino acid sequence with T. rangeli, showing the need for antigenic mapping of this protein in all trypanosomatids that showed high similarity with the T. cruzi and T. rangeli, for the presence of specific epitopes of T. cruzi. The 1F8 antigen may be a useful tool in the diagnosis of Chagas disease and will need to know more about the antigenic determinants to further develop poly-epitope synthetic adapted from a larger number of possible antigens, obtaining the highest specificity and sensitivity in tests serological diagnosis and rapid test for Chagas disease.This study represents a crucial step for the optimization of recombinant antigens for the diagnosis of Chagas disease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:BDTD_UERJ:oai:www.bdtd.uerj.br:4724 |
| Date | 19 April 2013 |
| Creators | Andressa da Matta Durans |
| Contributors | Rodolpho Mattos Albano, Wim Maurits Sylvain Degrave, Otacílio Cruz Moreira, David William Provance Junior |
| Publisher | Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação em Biociências, UERJ, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UERJ, instname:Universidade do Estado do Rio de Janeiro, instacron:UERJ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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