Simple mutations within the coding region of critical human genes can lead to the formation of abnormal proteins, resulting in various diseases (e.g. cancer), in failure of an embryo to develop, or premature death. Genetic diseases can only be truly cured via restoration of defective gene function and one of the most promising strategies is based on homologous recombination. Naturally homologous recombination occurs with a low frequency (1 in 106 transfected cells), however it is known that DNA double-strand breaks enhance the efficiency of homologous recombination by several orders of magnitude (up to 10,000-fold). Therefore, gene therapy via homologous recombination requires new molecular tools that should be highly specific and rigorously controllable.
In this work we have focused on the development of restriction enzyme-triple helix forming oligonucleotide (TFO) conjugates, where TFO provides specificity for the extended recognition site through the triple helix formation and addresses restriction enzyme to a particular target site where it introduces a double stranded break. We provide proof-of-concept demonstrations of two alternative strategies to control the DNA cleavage activity of restriction endonuclease-TFO conjugates, that allows adopt them in in vivo experiments. To this end we used restriction endonucleases MunI and Bse634I, which were structurally and biochemically characterized before in our laboratory. We successfully combined the restriction endonuclease... [to full text] / Mutacijos, atsiradusios atitinkamuose žmogaus genuose, gali lemti pakitusių baltymų atsiradimą, kurie sukelia įvairias ligas (pvz.: vėžį), klaidingą embriono vystymąsi ar priešlaikinę mirtį. Tokios genetinės ligos gali būti gydomos genų terapijos būdu. Labiausiai vystoma genų terapijos strategija yra paremta homologine rekombinacija, kurios metu DNR seka, naudojama geno taisymui, yra patiekiama in trans. Natūraliai žinduolių ląstelėse homologinė rekombinacija (HR) vyksta žemu rekombinacijos dažniu (10-6). Tačiau yra žinoma, kad dvigrandininio trūkio įvedimas žymiai pagreitina HR (10-1). In vivo eksperimentų atveju dvigrandininio trūkio įvedimas turi būti ypač tikslus, todėl šis metodas reikalauja naujų molekulinių įrankių, kurie būtų itin specifiški ir griežtai kontroliuojami.
Šiame darbe mes orientavomės į itin specifiškų ir griežtai kontroliuojamų meganukleazių kūrimą naudojant restrikcijos endonukleazių (REazių)-tripleksą formuojančių oligonukleotidų (TFO) konjugatus. REazių-TFO konjugatuose TFO suteikia specifiškumą prailgintam atpažinimo taikiniui per DNR triplekso susidarymą taip nukreipdamas restrikcijos fermentą prie konkretaus taikinio kur norima įvesti dvigrandininį trūkį. Šiuo tyrimu mes parodėme dvi alternatyvias restrikcijos endonukleazių-TFO konjugatų aktyvumo reguliavimo strategijas, kas leistų šias nukleazes panaudoti in vivo tyrimuose. Tuo tikslu buvo pasirinkti ortodoksiniai restrikcijos fermentai MunI ir Bse634I, kurie mūsų laboratorijoje yra gerai... [toliau žr. visą tekstą]
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LABT_ETD/oai:elaba.lt:LT-eLABa-0001:E.02~2012~D_20120702_082537-22107 |
| Date | 02 July 2012 |
| Creators | Šilanskas, Arūnas |
| Contributors | Sasnauskas, Kęstutis, Malinauskas, Albertas, Klimašauskas, Saulius, Lubys, Arvydas, Jakubauskas, Artūras, Daugelavičius, Rimantas, Serva, Saulius, Vilnius University |
| Publisher | Lithuanian Academic Libraries Network (LABT), Vilnius University |
| Source Sets | Lithuanian ETD submission system |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Doctoral thesis |
| Format | application/pdf |
| Source | http://vddb.laba.lt/obj/LT-eLABa-0001:E.02~2012~D_20120702_082537-22107 |
| Rights | Unrestricted |
Page generated in 0.0029 seconds