Si les modifications dans l’expression et les propriétés des mucines ont été largement décrites dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, la caractérisation structurale et fonctionnelle de la barrière de mucus reste parcellaire dans le contexte micro-inflammatoire du syndrome de l’intestin irritable (SII). Par ailleurs, certains traitements probiotiques préviennent la rupture de l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale, provoquée en conditions de stress mais peu de travaux décrivent leur influence sur les modifications de la structure du mucus, induites par le stress. Cette étude a comme objectifs d’évaluer chez le rat (i) si un stress chronique modifie le nombre de cellules à mucus et l’expression de la mucine Muc2, ainsi que la nature biochimique des mucines secrétées au niveau de l’iléon et du côlon, et plus particulièrement les O-glycanes, (ii) si un traitement probiotique (Lactobacillus farciminis) prévient les modifications du mucus potentiellement induites, (iii) si les effets observés sont en lien avec la capacité de colonisation in vivo de L. farciminis.Méthodes. Des rats Wistar mâles ont reçu L. farciminis ou une solution saline. Les animaux ont été soumis au stress d’évitement passif de l’eau (WAS) pendant 1h/jour ou à un stress fictif (contrôle), pendant les 4 derniers jours des traitements. Différents prélèvements ont été effectués au niveau de l’iléon et du côlon pour (i) des analyses sur coupes (immuno-marquage, nombre de cellules à mucus) et (ii) la détermination du profil de O-glycosylation des mucines. La morphologie de la couche de mucus a été évaluée par microscopie à force atomique (AFM). L. farciminis a été visualisé par "Fluorescence in situ Hybridization", confirmée par qPCR et son adhésion à la muqueuse a été déterminée par une méthode ex situ. La perméabilité paracellulaire et la sensibilité viscérale ont été évaluées.Résultats. Le WAS ne modifie pas le nombre de cellules à mucus ni l’expression de la mucine Muc2 aux niveaux iléal et colique. L’analyse par spectrométrie de masse a révélé que le stress induit des altérations de la O-glycosylation des mucines. Une augmentation marquée du degré de complexité des structures glycaniques a été observée, se traduisant par l’apparition de chaînes polylactosaminiques, sans modification toutefois du taux de sialylation et de sulfatation des mucines. La couche de mucus en condition de stress, observée par AFM, présente une morphologie aplatie et moins cohésive. L'hypothèse serait que les modifications structurales des O-glycanes influencent les interactions physico-chimiques entre les fibres de mucines, impactant de manière négative l’intégrité de la barrière de mucus. Cette altération de la couche de mucus s'accompagne d'un défaut de la barrière épithéliale et d'une hypersensibilité viscérale. L’administration de la souche probiotique prévient ces changements provoqués par le WAS. L. farciminis a été retrouvé au sein de l’iléon et du côlon. Par ailleurs, la présence de "Segmented Filamentous Bacteria" (SFB) a été mise en évidence, par FISH et microscopie électronique, au niveau de l’iléon sur l'ensemble des animaux testés. Le traitement par L. farciminis induit une diminution de la population des SFB aussi bien chez les animaux contrôles que stressés. Conclusion. Nous avons montré qu’un stress chronique chez le rat, outre les modifications fonctionnelles de l'épithélium intestinal (hyperperméabilité intestinale et hypersensibilité viscérale), altère la structure O-glycanique des mucines sans affecter l’expression de Muc2. Ces altérations se traduisent par une perte des propriétés cohésives de la couche de mucus. La souche probiotique L. farciminis, en prévenant l’ensemble des modifications induites par le stress, contribue au renforcement de la fonction barrière de l'intestin. Cette étude fournit un argumentaire complémentaire pour l’utilisation de cette souche dans le traitement du SII. / Background. Despite a large body of literature incriminating mucus alterations in the pathogenesis of Intestinal Bowel Diseases (IBD), structural and physical changes in the mucus layer remain poorly understood in the micro-inflammatory context of Irritable Bowel Syndrome (IBS). Moreover, some probiotic treatments prevent stress-induced intestinal epithelial barrier impairment but little is known about their influence on intestinal mucin structural modifications and mucus properties induced by stress. Thereby, this study aimed at evaluating whether (i) a chronic stress modified the number of gut goblet cells and Muc2 expression, nature of secreted mucins in both ileum and colon and more particularly mucin O-glycosylation, (ii) L. farciminis treatment prevented these alterations and (iii) observed effects were related to the in vivo colonization capacity of L. farciminis.Methods. Wistar rats received orally L. farciminis (1011 UFC/day) or vehicle (NaCl 0.9% (w/v)) for 14 days. From day 10 to day 14, they were submitted either to sham (control) or 4-day Water Avoidance Stress (WAS) during 1 hour per day. After sacrifice, different samples (tissues, mucosa) were collected in both ileal and colonic regions for (i) histological analyses (Muc 2 immunohistochemistry, number of goblet cells by Periodic Acid Schiff/Hemalun) and (ii) O-glycosylation profile by mass spectrometry after mucin extraction and purification. In parallel, the morphology of the mucus layer was evaluated by atomic force microscopy. Spatial localization of L. farciminis was assessed by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), confirmed by qPCR. Mucosal adhesion of L. farciminis was determined by an ex situ method. In complement, intestinal paracellular permeability and visceral sensitivity were measured.Results. WAS did not modify neither the number of intestinal goblet cells nor Muc2 expression in both ileum and colon. In contrast, the mass spectrometry analysis demonstrated that O-glycosylation of mucins was strongly affected by WAS. Indeed, a strongly increase in the complexity degree of O-glycan structures was observed in both ileum and colon, with the appearance of elongated polylactosaminic chains (repetition of the disaccharidic unit composed of galactose and N-acetylglucosamine), without modifications of mucin sialylation and sulfation. Under stress conditions, the mucus layer, observed by atomic force microscopy, showed a flattened morphology, probably indicative of a loss in its cohesive properties. We hypothesized that O-glycan structural modifications influence physico-chemical interactions between mucins fibers. Stress also induced intestinal hyperpermeability and visceral hypersensitivity. The mucus layer alteration was, thus, in relation with epithelial barrier impairment and visceral hypersensitivity. L. farciminis administration prevented WAS-induced functional, biochemical and physical changes of mucus. The presence of L. farciminis in the ileum and colon was detected by FISH and qPCR, albeit with quantitative and qualitative differences in the colonization capacity within these two intestinal compartments. Furthermore, the presence of Segmented Filamentous Bacteria (SFB) was shown in the ileum whatever the conditions under study. L. farciminis reduced the SFB population level in both control and stressed animals.Conclusion. Chronic stress induced functional changes (intestinal hyperpermeability and visceral hypersensitivity) in rats, as well as a shift in mucin O-glycosylation rather than changes in mucin expression. Intestinal mucin O-glycan modifications resulted in a loss of mucus layer cohesive properties. L. farciminis treatment prevented impairment of both intestinal epithelial and mucus barriers, reflecting an enhancement of the protective barrier function. These results confirm that L. farciminis is a valuable probiotic in the IBS management.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013ISAT0035 |
| Date | 07 November 2013 |
| Creators | Da Silva, Stéphanie |
| Contributors | Toulouse, INSA, Mercier, Muriel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French, English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
Page generated in 0.002 seconds