Le microbiote intestinal comprend l’ensemble des micro-organismes présents dans le tractus digestif. Cette flore et sa variabilité est unique et spécifique à chaque individu. L’équilibre microbien, état critique pour la santé, se développe progressivement à partir de la naissance. En complément de la fonction connue du microbiote dans la digestion, son rôle est maintenant avéré comme central dans le métabolisme humain. Dans cet écosystème complexe dans lequel cohabitent et interagissent 10¹³ bactéries, les Bacteroides, genre majoritaire au sein du microbiote, prennent en charge les fibres non digestibles de l’alimentation. Ces bactéries, anaérobies à Gram négatif, sont particulièrement bien adaptées à l’environnement intestinal tout particulièrement dans le domaine de la prise en charge des polysaccharides complexes et celui de la résistance à l’oxygène. Etonnamment, bien que l’hème soit un métabolite requis pour la croissance des Bacteroides, ces bactéries sont incapables de le synthétiser. L’hème, constitué d’un atome de fer fixé sur une porphyrie, est un cofacteur impliqué dans de nombreuses réactions enzymatiques essentielles au métabolisme central. Sa réactivité biochimique le rend responsable d’une induction de phénomènes inflammatoire de l’intestin. Nous avons étudié les interactions entre la bactérie Bacteroides thetaiotaomicron et l’hème environnemental. Nous avons d’abord développé un test permettant la détection de quantités d’hème de l’ordre du nanogramme dans des milieux complexes tels que le contenu intestinal. Nous avons ensuite montré que la bactérie commensale E. coli n’est pas la principale source d’hème lors de la colonisation du tractus digestif par Bacteroides dans un modèle de souris axénique et que l’hôte rempli ce rôle. Nous avons mis en place un système permettant de moduler la quantité d’hème présente dans le tractus digestif en piégeant la molécule sur l’hémophore HasA de Serratia marcescens. Nous avons confirmé que le système HasA était actif in vitro. Les résultats préliminaires montrent que d’une part il réduit la quantité d’hème intestinal disponible et d’autre part cela entraine un retard lors de la colonisation du tractus digestif par Bacteroides. Ce travail fournit des outils permettant de mieux comprendre les facteurs influant sur l’implantation des Bacteroides et souligne l’importance de l’hème dans le processus crucial de la primo-colonisation. Mais cela autorise également à plus long terme d’envisager l’utilisation de ce système pour diminuer la quantité d’hème disponible dans l’intestin et donc son effet pro-inflammatoire, dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. / The intestinal microbiota comprises the numerous microorganisms colonizing the digestive tract. This flora, and the variations it undergoes are unique and specific to each individual. The microbial balance, which is a determinant of our state of health, develops gradually from birth. In addition to the known roles of the microbiote in digestion, it is now recognized as an important contributor to human metabolism. Among the 10¹³ bacteria inhabiting the human gut, the genus Bacteroides comprises the dominant genus, and is needed to digest complex dietary polysaccharide fibers. This feature, and the resistance to trace oxygen of these Gram-negative anaerobes make them particularly well adapted to the intestinal environment. Remarkably, although heme is a required metabolite for Bacteroides growth, these bacteria are incapable of heme synthesis. Heme, which comprises an iron atom trapped within a porphyrin ring, is a cofactor involved in numerous enzymatic reactions essential to central metabolism. Its bioactivity may also provoke intestinal inflammatory phenomena. We investigated the interactions between the bacterium Bacteroides thetaiotaomicron and environmental heme. We first developed a test to detect nanogram amounts of heme in complex media such as intestinal contents. We then showed that the commensal bacterium Escherichia coli donates heme to B. thetaiotaomicron in vitro. Nevertheless, we found that E. coli is not the major heme source for Bacteroides colonization, as tested in a germfree mouse model. This study led us to conclude that the host must be the major heme donor. We then set up a system to modulate heme availability in the digestive tract by capturing free heme on a hemophore HasA, from Serratia marcescens. We confirmed the HasA system was active in vitro. Preliminary experiments indicate that it 1- reduces levels of intestinal heme, and 2- delays B. thetaiotaomicron colonization. The present work provides tools for better understanding the factors needed for Bacteroides implantation in the gut and underlines the importance of heme in this crucial process of primocolonization. In the longer term, the bacterial heme-capture system may be considered as a means of decreasing free intestinal pools of heme and thereby its pro-inflammatory effect, in chronic inflammatory bowel diseases.

Si les modifications dans l’expression et les propriétés des mucines ont été largement décrites dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, la caractérisation structurale et fonctionnelle de la barrière de mucus reste parcellaire dans le contexte micro-inflammatoire du syndrome de l’intestin irritable (SII). Par ailleurs, certains traitements probiotiques préviennent la rupture de l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale, provoquée en conditions de stress mais peu de travaux décrivent leur influence sur les modifications de la structure du mucus, induites par le stress. Cette étude a comme objectifs d’évaluer chez le rat (i) si un stress chronique modifie le nombre de cellules à mucus et l’expression de la mucine Muc2, ainsi que la nature biochimique des mucines secrétées au niveau de l’iléon et du côlon, et plus particulièrement les O-glycanes, (ii) si un traitement probiotique (Lactobacillus farciminis) prévient les modifications du mucus potentiellement induites, (iii) si les effets observés sont en lien avec la capacité de colonisation in vivo de L. farciminis.Méthodes. Des rats Wistar mâles ont reçu L. farciminis ou une solution saline. Les animaux ont été soumis au stress d’évitement passif de l’eau (WAS) pendant 1h/jour ou à un stress fictif (contrôle), pendant les 4 derniers jours des traitements. Différents prélèvements ont été effectués au niveau de l’iléon et du côlon pour (i) des analyses sur coupes (immuno-marquage, nombre de cellules à mucus) et (ii) la détermination du profil de O-glycosylation des mucines. La morphologie de la couche de mucus a été évaluée par microscopie à force atomique (AFM). L. farciminis a été visualisé par "Fluorescence in situ Hybridization", confirmée par qPCR et son adhésion à la muqueuse a été déterminée par une méthode ex situ. La perméabilité paracellulaire et la sensibilité viscérale ont été évaluées.Résultats. Le WAS ne modifie pas le nombre de cellules à mucus ni l’expression de la mucine Muc2 aux niveaux iléal et colique. L’analyse par spectrométrie de masse a révélé que le stress induit des altérations de la O-glycosylation des mucines. Une augmentation marquée du degré de complexité des structures glycaniques a été observée, se traduisant par l’apparition de chaînes polylactosaminiques, sans modification toutefois du taux de sialylation et de sulfatation des mucines. La couche de mucus en condition de stress, observée par AFM, présente une morphologie aplatie et moins cohésive. L'hypothèse serait que les modifications structurales des O-glycanes influencent les interactions physico-chimiques entre les fibres de mucines, impactant de manière négative l’intégrité de la barrière de mucus. Cette altération de la couche de mucus s'accompagne d'un défaut de la barrière épithéliale et d'une hypersensibilité viscérale. L’administration de la souche probiotique prévient ces changements provoqués par le WAS. L. farciminis a été retrouvé au sein de l’iléon et du côlon. Par ailleurs, la présence de "Segmented Filamentous Bacteria" (SFB) a été mise en évidence, par FISH et microscopie électronique, au niveau de l’iléon sur l'ensemble des animaux testés. Le traitement par L. farciminis induit une diminution de la population des SFB aussi bien chez les animaux contrôles que stressés. Conclusion. Nous avons montré qu’un stress chronique chez le rat, outre les modifications fonctionnelles de l'épithélium intestinal (hyperperméabilité intestinale et hypersensibilité viscérale), altère la structure O-glycanique des mucines sans affecter l’expression de Muc2. Ces altérations se traduisent par une perte des propriétés cohésives de la couche de mucus. La souche probiotique L. farciminis, en prévenant l’ensemble des modifications induites par le stress, contribue au renforcement de la fonction barrière de l'intestin. Cette étude fournit un argumentaire complémentaire pour l’utilisation de cette souche dans le traitement du SII. / Background. Despite a large body of literature incriminating mucus alterations in the pathogenesis of Intestinal Bowel Diseases (IBD), structural and physical changes in the mucus layer remain poorly understood in the micro-inflammatory context of Irritable Bowel Syndrome (IBS). Moreover, some probiotic treatments prevent stress-induced intestinal epithelial barrier impairment but little is known about their influence on intestinal mucin structural modifications and mucus properties induced by stress. Thereby, this study aimed at evaluating whether (i) a chronic stress modified the number of gut goblet cells and Muc2 expression, nature of secreted mucins in both ileum and colon and more particularly mucin O-glycosylation, (ii) L. farciminis treatment prevented these alterations and (iii) observed effects were related to the in vivo colonization capacity of L. farciminis.Methods. Wistar rats received orally L. farciminis (1011 UFC/day) or vehicle (NaCl 0.9% (w/v)) for 14 days. From day 10 to day 14, they were submitted either to sham (control) or 4-day Water Avoidance Stress (WAS) during 1 hour per day. After sacrifice, different samples (tissues, mucosa) were collected in both ileal and colonic regions for (i) histological analyses (Muc 2 immunohistochemistry, number of goblet cells by Periodic Acid Schiff/Hemalun) and (ii) O-glycosylation profile by mass spectrometry after mucin extraction and purification. In parallel, the morphology of the mucus layer was evaluated by atomic force microscopy. Spatial localization of L. farciminis was assessed by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), confirmed by qPCR. Mucosal adhesion of L. farciminis was determined by an ex situ method. In complement, intestinal paracellular permeability and visceral sensitivity were measured.Results. WAS did not modify neither the number of intestinal goblet cells nor Muc2 expression in both ileum and colon. In contrast, the mass spectrometry analysis demonstrated that O-glycosylation of mucins was strongly affected by WAS. Indeed, a strongly increase in the complexity degree of O-glycan structures was observed in both ileum and colon, with the appearance of elongated polylactosaminic chains (repetition of the disaccharidic unit composed of galactose and N-acetylglucosamine), without modifications of mucin sialylation and sulfation. Under stress conditions, the mucus layer, observed by atomic force microscopy, showed a flattened morphology, probably indicative of a loss in its cohesive properties. We hypothesized that O-glycan structural modifications influence physico-chemical interactions between mucins fibers. Stress also induced intestinal hyperpermeability and visceral hypersensitivity. The mucus layer alteration was, thus, in relation with epithelial barrier impairment and visceral hypersensitivity. L. farciminis administration prevented WAS-induced functional, biochemical and physical changes of mucus. The presence of L. farciminis in the ileum and colon was detected by FISH and qPCR, albeit with quantitative and qualitative differences in the colonization capacity within these two intestinal compartments. Furthermore, the presence of Segmented Filamentous Bacteria (SFB) was shown in the ileum whatever the conditions under study. L. farciminis reduced the SFB population level in both control and stressed animals.Conclusion. Chronic stress induced functional changes (intestinal hyperpermeability and visceral hypersensitivity) in rats, as well as a shift in mucin O-glycosylation rather than changes in mucin expression. Intestinal mucin O-glycan modifications resulted in a loss of mucus layer cohesive properties. L. farciminis treatment prevented impairment of both intestinal epithelial and mucus barriers, reflecting an enhancement of the protective barrier function. These results confirm that L. farciminis is a valuable probiotic in the IBS management.