Suite à la pandémie de COVID-19, l’utilisation de l’ARNm en tant qu’agent thérapeutique s’est révélé prometteur pour la lutte contre les maladies infectieuses. Cependant, l’un des principaux défis à surmonter est la nécessité de préserver l’intégrité de l’ARNm contre la dégradation enzymatique qui peut entraver son efficacité thérapeutique.
L’utilisation du chitosane comme vecteur de livraison a engendré beaucoup d’intérêt dû à ses propriétés de biocompatibilité, biodégradation et de faible toxicité. Lorsqu’il est associé à l’ARNm, le chitosane forme des nanoparticules grâce à une interaction électrostatique entre la charge positive du chitosane et la charge négative de l’ARNm. Notre laboratoire a synthétisé un nanovecteur composé de CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ avec des modifications incorporées sous forme d’ajout de groupes DIPEA et PEG. Ces modifications sont conçues pour augmenter la stabilité et prolonger la demi-vie des nanoparticules. Le but de notre projet est de développer une nouvelle nanoplateforme vaccinale basée sur l’utilisation de nanoparticules CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/ARNm qui permettra de protéger l’ARNm contre la dégradation enzymatique et à faciliter sa livraison à son site d’action in vitro.
Les nanoparticules CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/ARNm ont été caractérisées par DLS pour mesurer la taille ainsi que le potentiel zêta. Ensuite, des essais ont été réalisés sur la complexation, l’encapsulation et la libération de l’ARNm du polymère CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅. Ces derniers ont montré une complexation totale à ratio N/P 3 :1 ainsi qu’une efficacité d’encapsulation de 95%. Par la suite, des évaluations de cytotoxicité ont été effectuées sur trois lignées cellulaires : les Caco-2, RAW 264.7 et HEKa. Les nanoparticules ont montré une viabilité cellulaire de 98.58 ± 8.1%, 91.52 ± 4.25% et 97.65 ± 4.3% respectivement. Les essais de stabilité ont montré que ces nanoparticules étaient capables de protéger l’ARNm contre la dégradation par les RNases pendant une période allant jusqu’à 48h. Enfin, des études de transfection ont été confirmées par microscopie confocale. Nos nanoparticules ont montré une bonne capacité de protection ainsi qu’une efficacité d’internalisation dans les trois lignées cellulaires. Cependant, il n’a pas été possible d’observer l’expression protéique de la protéine EGFP correspondant à l’ARNm utilisé. On suggère que c’est dû aux fortes interactions entre le chitosane et l’ARNm qui empêche sa libération une fois qu’il est internalisé. Il est donc nécessaire de poursuivre les recherches pour améliorer les modifications apportées au vecteur CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ afin de trouver un équilibre entre la protection de l’acide nucléique et sa libération. / Due to the COVID-19 pandemic, the use of mRNA as a therapeutic agent in fighting
infectious illnesses has shown a great potential. However, one of the key hurdles to
overcome is the requirement to protect mRNA against enzymatic degradation, which
might impair its therapeutic efficacy.
Because of its biocompatibility, biodegradability, and low toxicity, the use of chitosan as
a delivery vector has gained significant interest. When associated with mRNA, chitosan
forms nanoparticles through electrostatic interaction between the positive charge of
chitosan and the negative charge of mRNA. Our laboratory has synthesized a nanocarrier
composed of CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ with incorporated modifications in the form of DIPEA
and PEG groups. These modifications are intended to improve nanoparticle stability and
lengthen their half life. Our project’s objective is to create a novel vaccine nanoplatform
based on the use of CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/mRNA nanoparticles that will protect mRNA from
enzymatic degradation and enable its delivery to its in vitro location.
DLS was used to determine the size and zeta potential of the CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅/mRNA
nanoparticles. Following that, experiments on the complexation, encapsulation and
release of mRNA from CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ were performed. These experiments showed
full complexation at N/P ratio of 3:1 and and an encapsulation efficiency of 95%. Following
that, three cell lines were tested for cytotoxicity: Caco-2, RAW 264.7, and HEKa. The cell
viability of nanoparticles was 98.58 ± 8.1%, 91.52 ± 4.25% and 97.65 ± 4.3%, respectively.
Stability tests showed that these nanoparticles could protect mRNA from RNase
degradation for up to 48 hours. Finally, transfection studies were confirmed by confocal
microscopy. In all three cell lines, our nanoparticles showed good protection and
internalization efficiency. However, it was not possible to observe the protein expression
of the EGFP protein corresponding to the used mRNA. It is suggested that this is due to strong interactions between chitosan and mRNA,
preventing its release once internalized. As a result, more study is required to optimize
the modifications made to the CH-DIPEA₅₃-PEG₁.₁₅ vector in order to achieve a balance
between nucleic acid protection and release.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32653 |
| Date | 10 1900 |
| Creators | Benabdoun, Inès |
| Contributors | Fernandes, Julio, Perreault, Jonathan |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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