L’usage excessif d’antibiotiques a provoqué l’émergence de résistance, constituant un problème sanitaire mondial. L’antibiotique triméthoprime (TMP) inhibe l’enzyme dihydrofolate réductase (FolA) des bactéries, interrompant la production d’un précurseur essentiel dans la synthèse des purines et empêchant ainsi la croissance bactérienne. Cependant, certaines bactéries produisent une seconde dihydrofolate réductase : une DfrB, appartenant à une famille d’enzymes hautement résistantes au TMP. Actuellement, dix membres de la famille DfrB ont été identifiés, qui partagent une identité de séquence élevée (74 – 98 %). Les enzymes DfrB sont constituées de domaines identiques de 78 acides aminés, de type ‘SH3-like’, qui s’homotétramérisent afin de former l’enzyme active. Les DfrB ne partagent aucune homologie de séquence ou de structure avec les FolA et aucun antibiotique n’a encore été développé pour contourner la résistance au TMP causée par les DfrB. Afin de mieux comprendre le domaine SH3-like, des homologues (DfrB-H) partageant 10 à 80 % d’identité avec la DfrB1 ont été identifiés et caractérisés. Ils possèdent une activité dihydrofolate réductase (Dfr) et confèrent de la résistance au TMP. De plus, afin de vérifier si les gènes dfrB se retrouvent dans divers environnements, une recherche dans une base de données métagénomiques a été entreprise, permettant de caractériser 10 nouvelles séquences homologues aux DfrB connues. En 2012, le groupe Pelletier a rapporté le premier inhibiteur spécifique d’une DfrB, et plusieurs autres depuis. Seule la DfrB1 a été caractérisée concernant son profil d’inhibition ainsi que sa thermostabilité inhabituelle. Ici, une méthode semi-automatisée sera développée pour caractériser les profils d’inhibition, de thermostabilité, de résistance au TMP et d’activité enzymatique de toutes les DfrB et des homologues identifiés, afin de les comparer à ceux de la DfrB1. Pour atteindre ces objectifs, des nouvelles méthodes à haut débit de détermination d’activité ainsi que des tests de concentration minimale inhibitrice (CMI) furent développés. Ces méthodes ont permis de déterminer que les profils de thermostabilité et d’inhibition de plusieurs DfrB et DfrB-H sont comparables aux profils de la DfrB1. De plus, le criblage de dizaines de composés potentiellement inhibiteurs a été effectué afin de poursuivre la recherche d’inhibiteurs spécifiques aux DfrB. En outre, nous signalons 10 nouvelles séquences homologues de DfrB qui confèrent une résistance élevée au TMP et possèdent une activité Dfr. La caractérisation de tous les membres DfrB et les homologues nous permettra d’acquérir une meilleure connaissance de leur mécanisme de résistance, de leur prévalence dans divers environnements et de soutenir notre développement de nouveaux inhibiteurs des DfrB. / The intensive usage of antibiotics has provoked the emergence of antibiotic resistance, causing a worldwide health issue. The antibiotic trimethoprim (TMP) targets the microbial dihydrofolate reductase enzyme (FolA), abrogating the production of an essential precursor in the synthesis of purines and thus preventing bacterial proliferation. However, some bacteria produce an additional dihydrofolate reductase: the highly TMP-resistant DfrB. Currently, ten DfrB family members have been identified, that share high sequence identity (74 – 98 %). DfrB enzymes consist of identical, 78 amino acid-long SH3-like domains, that homotetramerize to form the active enzyme. DfrB share no sequence or structural homology with FolA and no antibiotic has yet been developed to circumvent the TMP resistance caused by DfrB. In order to gain insight into the SH3-like domain of DfrB, homologues (DfrB-H) sharing 10 to 80 % identity with DfrB1 were identified and characterized, which displayed dihydrofolate reductase (Dfr) activity and conferred high TMP resistance. Also, to investigate if dfrB genes are identified in various environments, a metagenomic database search was undertaken to characterize ten new DfrB1 homologue sequences. In 2012, the Pelletier group reported the first specific inhibitor of a DfrB, and several others since. Only DfrB1 has been characterized regarding its inhibition profile as well as its unusual thermostability. Here, semi-automated methods will be developed to compare the inhibition, thermostability, TMP-resistance and enzymatic activity profiles of all DfrB and DfrB homologues to those of DfrB1. To address this objective, new high-throughput activity assays as well as Minimal Inhibitory Concentration (MIC) assays were developed. Using those methods, we determined that thermostability and inhibition profiles of several DfrB and DfrB-H were comparable to those of DfrB1. Also, a screen of several dozen potential inhibitory compounds was performed, to attempt to identify further specific DfrB inhibitors. In addition, we report 10 new DfrB homologues that confer high TMP resistance and possess Dfr activity. The characterization of all DfrB members and DfrB homologues will allow us to acquire greater knowledge on their antimicrobial resistance mechanism, their prevalence in different environments and support our development of new DfrB-specific inhibitors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/28252 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Lafontaine, Kiana |
| Contributors | Pelletier, Joelle |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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