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Previous issue date: 2014-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Evaluation of the pharmacokinetic and toxicological profile is essential in the study of new drugs. However, these studies are rare and have been performed, in many cases, after the onset of clinical studies. Trachylobane-360 (T-360), a diterpene ent-7-acetoxytrachyloban-18-oic acid, obtained from Xylopia langsdorffiana, shows antitumor and spasmolytic activities, making it a promising molecule. Moreover, there are no reports on the toxicological and pharmacokinetic studies of this natural product. Considering all these aspects, the present study aimed to evaluate the toxicity and pharmacokinetics of T-360. In the acute toxicity test in mice, the T-360 showed low toxicity at doses of 50 mg/kg (i.v.), and 300 mg/kg (i.p.), showing no significant behavioral and haematological changes. However, the dose of 300 mg/kg (i.v.) caused death in four out of six animals (LD50 of 200 mg/kg). T-360 was not genotoxic in micronucleus assay, because it does not increase the frequency of micronucleated erythrocytes of mice treated with 25, 150 and 300 mg/kg (i.p.). Among the appropriate bioanalytical techniques for pharmacokinetic study highlights the high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MSn). A HPLC/MSn method developed consisted of ESI ionization, in negative mode, basifying the medium, with detection of molecular ion 359 m/z. The fragmentation study showed that the ion 359 m/z is fragmented into 299 m/z, which is used to detect T-360. The best chromatographic conditions were established: C18 column under isocratic elution with mobile phase consisting of H2O:MeCN (65:35) and 0.1% of NH4OH in the aqueous phase. In method developing of extracting the T-360 in whole blood was evaluated influences the type of extracting solvent and different times and centrifugation forces. T-360 was better recovered (37.02%) of the blood matrix using CHCl3 and 14,000 xg for 15 min, showing the matrix effect and efficiency of the extraction process of -51.23% and 18.05 %, respectively. After optimization of the method, repeating the procedure and acidifying the sample, there was an increase recovery of T-360 (49.47%), reduction of matrix effect (-37.60%) and increase the efficiency of the process extraction (32.24%). In the validation of analytical method for quantification of T-360 in whole blood, using the Riparina I as internal standard (PI), the method presented himself as selective/specific, linear over the concentration range evaluated, accurate and precise. Moreover, presented limit of detection and quantification of 50 and 100 ng/mL, respectively. Finally, pharmacokinetic parameters were obtained by applying the validated method to samples of blood collected from mice subjected to treatment with T-360 at a dose of 25 mg/kg (i.v.), Obtaining the following results: Cmax of 321,34 μg/mL, t1/2 of 3,89 min, Ke of 10,68 h-1 CLs of 830,97 mL/h/kg and Vd 0,08 L/kg, which characterizes tissue distribuition. From the data analysis, it can be suggested that the T-360 continues to be a promising molecule having low toxicity. Furthermore, the pharmacokinetic results propel the continued investigation of other parameters, using other routes of administration, and the study of metabolites responsible, at least in part, by anti-tumor activity. / A avaliação do perfil farmacocinético e toxicológico é essencial no estudo de novos candidatos a fármacos. No entanto, estes estudos são escassos e vêm sendo realizados, em muitos casos, após o início dos ensaios clínicos. Trachylobano-360 (T-360), o diterpeno ácido ent-7-acetoxitrachylobano-18-óico, obtido de Xylopia langsdorffiana, apresenta atividades antitumoral e espasmolítica, tornando-se uma molécula promissora. Além disso, não há relatos na literatura de estudos toxicológicos e farmacocinéticos deste produto natural. Considerando todos esses aspectos, o presente trabalho objetivou avaliar a toxicidade e a farmacocinética do T-360. No ensaio de toxicidade aguda em camundongos, o T-360 mostrou baixa toxicidade nas doses de 50 mg/kg (e.v.) e 300 mg/kg (i.p.), não induzindo nenhuma alteração comportamental e hematológica significantes. Porém, a dose de 300 mg/kg (e.v.) provocou morte em quatro de seis animais (DL50 estimada em 200 mg/kg). O T-360 não se mostrou genotóxico no ensaio do micronúcleo, pois não aumentou a frequência de eritrócitos micronucleados de camundongos tratados com 25, 150 e 300 mg/kg (i.p.). Dentre as técnicas bioanalíticas apropriadas para o estudo farmacocinético, destaca-se a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas (CLAE-EMn). Foi desenvolvido um método CLAE-EMn que consistiu em ionização por ESI, em modo negativo, basificando o meio, com detecção do íon molecular 359 m/z. O estudo de fragmentação mostrou que o íon 359 m/z é quebrado em 299 m/z, sendo esta fragmentação utilizada para detecção do T-360. As melhores condições cromatográficas estabelecidas foram: eluição isocrática em coluna C18, com fase móvel composta de H2O:MeCN (65:35) e 0,1% de NH4OH na fase aquosa. No desenvolvimento do método de extração do T-360 em sangue total avaliou-se as influências do tipo de solvente extrator e diferentes tempos e forças de centrifugação. O T-360 foi melhor recuperado (37,02%) da matriz sangue utilizando CHCl3 e 14.000 x g por 15 min, apresentando efeito de matriz e eficiência do processo de extração de -51,23% e 18,05%, respectivamente. Após a otimização do método, repetindo-se o procedimento e acidificando a amostra, houve aumento da recuperação do T-360 (49,47%), diminuição do efeito de matriz (-37,60%) e aumento da eficiência do processo de extração (32,24%). Na validação do método analítico para quantificação do T-360 em sangue total, utilizando a Riparina I como padrão interno (PI), o método apresentou-se como seletivo/específico, linear no intervalo de concentrações avaliado, exato e preciso. Além disso, apresentou limite de detecção e quantificação de 50 e 100 ng/mL, respectivamente. Por último, parâmetros farmacocinéticos foram obtidos através da aplicação do método validado às amostras de sangue coletadas de camundongos submetidos ao tratamento com T-360 na dose de 25 mg/kg (e.v.), obtendo-se como resultados: Cmax de 321,34 μg/mL, t1/2 de 3,89 min, Ke de 10,68 h-1, CLs de 830,97 mL/h/kg e Vd 0,08 L/kg, o que caracteriza distribuição tecidual. A partir das análises dos dados, pode-se sugerir que o T-360 continua sendo uma molécula promissora por apresentar baixa toxicidade. Além disso, os resultados farmacocinéticos obtidos impulsionam a continuidade da investigação de outros parâmetros, usando outras vias de administração, e o estudo de metabólitos responsáveis, pelo menos em parte, pela atividade antitumoral.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.biblioteca.ufpb.br:tede/8059 |
| Date | 26 February 2014 |
| Creators | Pita, João Carlos Lima Rodrigues |
| Contributors | Sobral, Marianna Vieira |
| Publisher | Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, UFPB, Brasil, Farmacologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFPB, instname:Universidade Federal da Paraíba, instacron:UFPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -3526991091727869, 600, 600, 600, 600, 1949513326075358303, 700814650651154363, -2555911436985713659 |
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