A transformação plastidial oferece uma série de vantagens em relação à transformação nuclear, como: altos níveis de expressão de proteínas, capacidade de expressar múltiplos transgenes em operons e contenção gênica pela ausência de transmissão pelo pólen. Devido ao alto número de cópias do genoma plastidial por cloroplasto e ao alto número de cloroplastos por células vegetais, são necessários ciclos de regeneração sob condições seletivas para obter transformantes homoplásmicos. A análise de homoplasmia é realizada pela metodologia de Southern blot ou pelo teste de herança do transgene pela germinação de sementes em meio seletivo. O Southern blot é trabalhoso, demorado e para maior sensibilidade envolve o uso de radioisótopos, enquanto o teste de germinação é realizado somente após a produção de sementes necessitando de um ciclo de reprodução da planta. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido, sensível e eficaz para determinar o grau de homoplasmia de plantas transplastômicas, baseado na técnica de PCR em tempo real. Folhas de fumo foram transformadas com vetores compostos pelos genes 9 dessaturase (pMR1), 15 dessaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) e 12/3 dessaturase (pMR10), todos contendo o gene de seleção aadA. No total, 44 plantas foram obtidas, sendo 21 plantas positivas para a inserção do transgene. O grau de homoplasmia foi determinado pela proporção entre o número de cópias do transgene e o número de cópias do gene endógeno. Inicialmente, misturas de DNA de plantas transplastômicas homoplásmicas (pMR1 e pMR3) com DNA de planta tipo selvagem foram preparadas para simular diferentes graus de homoplasmia. DNA da planta transplastômica ou do plasmídeo foi diluído em série para construção das curvaspadrão, com a quantidade dos genes sendo estimada por meio da plotagem nessas curvas. Os índices de homoplasmia detectados na PCR em tempo real foram compatíveis com os resultados do teste de germinação com valores abaixo de 1 para plantas heteroplásmicas, 1 para a planta homoplásmica e 0 para as plantas sem a inserção do transgene. Os resultados das análises de amostras coletadas após o primeiro ciclo de regeneração mostraram que 13 das 21 plantas já se apresentavam em estado homoplásmico não sendo necessários mais ciclos de regeneração. A PCR em tempo real mostrou ser um método eficiente para análise do grau de homoplasmia de plantas transplastômicas. / Plastid transformation offers several advantages in relation to nuclear transformation, such as high-level of protein expression, the feasibility of expressing multiple transgenes in operons and gene containment through the lack of pollen transmission. Due to the high copy number of plastidial genome in chloroplasts and the high number of chloroplasts per plant cells, regeneration cycles under selective conditions are necessary to obtain homoplasmic transformants. Homoplasmy analysis is performed by Southern blot methodology or transgene inheritance test through seed germination in selective medium. Southern blot is laborious, time consuming and for more sensitivity it would require the use of radioisotopes, while germination test can be performed only after seed production which require a plant reproduction cycle. The objective of this study was to develop a fast, sensitive and effective method to determine the homoplasmy degree of transplastomic plants, based on real-time PCR. Tobacco leaves were transformed with vectors containing the 9 desaturase (pMR1), 15 desaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) and 12/3 desaturase (pMR10) each one with the aadA selection gene. In total, 44 plants were obtained, of which 21 were positive for the insertion of the transgene. The homoplasmy degree was determined by the proportion between the number of transgene copies and the number of endogenous gene copies. Initially, mixtures of homoplastomic plants DNA (pMR1 and pMR3) with wild-type plant DNA were prepared to simulate different degrees of homoplasmy. Transplastomic plant DNA or plasmid DNA was diluted to construct the standard curves and the gene amount was detected by plotting in this curves. The homoplasmy rate detected in real-time PCR were consistent with the results of germination test with values below 1 for heteroplasmic plants, 1 for homoplasmic plants and 0 for plants without the transgene insertion. The results obtained from the samples collected after the first regeneration cycle showed that 13 of the 21 plants were already in a homoplasmic state and did not require more cycles of regeneration. The real-time PCR proved to be an effective method for analyzing the homoplasmy degree of transplastomic plants.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07022012-161104 |
| Date | 10 January 2012 |
| Creators | Tanaka, Simone Missae |
| Contributors | Carrer, Helaine |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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