Mais de 95% de luz ultravioleta (UV) que atinge a superfície da Terra corresponde ao comprimento de onda da luz UVA (315-400 nm). A luz UVA induz no DNA danos pela absorção direta e indireta dos fótons, bem como por intermédio de cromóforos. Pacientes com Xeroderma Pigmentosum Variante (XP-V) possuem mutações na DNA polimerase η (pol eta), que promove a síntese translesão dos danos induzidos pela luz solar. Na ausência dessa polimerase há aumento da mutagênese, provável causa de câncer de pele em pacientes XP-V. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os mecanismos de indução de danos no genoma e mutagênese por luz UVA, em células derivadas desses pacientes. Os resultados indicam que a exposição à luz UVA resultou em maior sensibilidade de células XP-V comparadas à linhagem controle. Os níveis de fosforilação da histona H2AX (gerando γH2AX - indicador de indução de danos no genoma) e detecção de danos diretos e indiretos no DNA apresentou um aumento significativo em células XP-V irradiadas com luz UVA. Curiosamente, na ausência de pol eta houve uma redução na capacidade de remoção das lesões formadas. Além disso, a irradiação com luz UVA causou forte bloqueio de replicação do DNA e parada do ciclo celular em fase S em células XP-V, desencadeando importantes respostas mediadas por ATR/Chk1. Surpreendentemente, o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) resultou em diminuição da sensibilidade celular, dos níveis de γH2AX, da parada de forquilha de replicação e do ciclo celular, reduziu os efeitos citotóxicos da inibição de ATR, melhorou o reparo de lesões no DNA e preveniu a carbonilação de proteínas em células XP-V irradiadas com luz UVA. Investigamos também a indução de mutagênese nas células irradiadas com luz UVA, através de sequenciamento de exoma de clones celulares. Os dados indicaram um aumento significativo da mutagênese em células XP-V irradiadas comparadas a células controle, e pela avaliação dos tipos de mutações encontradas verificamos uma frequência bastante alta de transições C>T, provavelmente como consequência de replicação errônea de dímeros de pirimidina. Entretanto, também identificamos indução significativa de transversões C>A, provavelmente devido a lesões oxidadas no genoma. Curiosamente, ao compararmos células XP-V com células controle detectamos um aumento desse último tipo de mutação na ausência de pol eta, provavelmente devido a lesões endógenas, produzidas pela oxidação do DNA. Além disso, análises in silico mostraram que células XP-V irradiadas com UVA apresentaram assinatura mutacional similar ao observado para tumores de pele. Os dados claramente indicam que células XP-V são sensíveis a irradiação com UVA e que os danos promovidos no DNA, incluindo aqueles causados por estresse oxidativo, desencadeiam respostas celulares e mutagênese nesses pacientes. Assim, além de apontar que UVA pode gerar efeitos deletérios na pele de pacientes XP-V, nossos dados também contribuem para a compreensão de como esses comprimentos de onda podem atuar em células humanas em geral / More than 95% of ultraviolet-light (UV) that reaches the Earth surface corresponds to UVA wavelengths (315-400 nm). UVA-light induces DNA damage through direct and indirect absorption of photons, as well as, intermediated by chromophores and by oxidation mechanisms. Xeroderma Pigmentosum Variant (XP-V) patients are defective in DNA polymerase η (pol eta) that performs translesion synthesis of sunlight induced DNA damage. Absence of pol eta results in increased mutagenesis, which is probably responsible for high frequency of skin cancer in XP-V patients. The goal of this work was to characterize the mechanisms of UVA-induced genome DNA damage and mutagenesis in cells derived from these patients. The results indicate that UVA irradiation increased cell death of XP-V compared to control cell line. The phosphorylation of the histone H2AX (generating γH2AX, an indicator of genotoxic stress) and DNA damage was highly increased in UVA irradiated XP-V cells. Curiously, however, in the absence of pol eta, there was a reduction in the capacity of cells to remove DNA damage from genome. Moreover, UVA irradiation triggered strong DNA synthesis blockage and cell cycle arrest in S phase, resulting in important responses mediated by the ATR/Chk1 pathway in XP-V cells. Interestingly, the antioxidant N-acetyl cysteine (NAC) resulted in decreased cell sensitivity, γH2AX levels, fork stalling and cell cycle arrest, reduced the cytotoxic effect of ATR inhibition, improved DNA repair and prevented the protein carbonylation in XP-V cells irradiated with UVA. The mutagenesis by UVA-light was also investigated by exome DNA sequencing of cellular clones. The data indicated a significative increase of mutagenesis in XP-V irradiated cells compared to control cells, and the identification of mutation types indicated a high increase of C>T transitions, probably as result of error-prone replication of pyrimidine dimers. Nevertheless, the induction of C>A transversions were also detected, probably due to oxidized DNA damage. Curiously, when XP-V and control cells were compared, in the absence of irradiation, these transversions were also detected, maybe due to endogenous oxidation of DNA. In addition, in silico analyses showed that UVA-irradiated XP-V cells had a mutation signature similar to the observed for skin cancer. The data demonstrate XP-V cells are sensitive to UVA-light and DNA damage, including by oxidative stress, trigger cell responses and induce mutagenesis in these patients. Therefore, besides showing that UVA-irradiation may generate deleterious effects in the skin of XP-V patients, the data also contribute to understand how these light wavelengths may damage human cells in general
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22012018-162542 |
| Date | 11 October 2017 |
| Creators | Moreno, Natalia Cestari |
| Contributors | Garcia, Camila Carrião Machado, Menck, Carlos Frederico Martins |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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