Influenza, também conhecida como gripe, é uma doença infecciosa viral que acomete um grande número de indivíduos anualmente, sendo responsável por um elevado número de internações e óbitos. O agente etiológico é o Myxovirus influenzae, vírus envelopado, de RNA de fita simples e polaridade negativa. A vacinação é a forma mais eficaz de se prevenir a infecção pelo vírus, no entanto, a capacidade produtiva dessa vacina não é suficiente para a vacinação da totalidade da população mundial, principalmente em casos de pandemia. Esse projeto teve por objetivo desenvolver uma vacina influenza (fragmentada e inativada) adjuvada, visando aumentar a capacidade produtiva dessa vacina no Instituto Butantan, que hoje é estimada em aproximadamente 40 milhões de doses por campanha. A utilização de adjuvantes na formulação da vacina influenza é capaz de produzir a mesma resposta imunológica protetora contra esse vírus, utilizando uma quantidade menor dos antígenos vacinais, aumentando a capacidade de produção da vacina em até quatro vezes. Foram estudadas 23 formulações adjuvantes utilizando o esqualeno como referência (formulação similar ao MF59®, adjuvante desenvolvido pela Novartis), vitaminas lipossolúveis (vitaminas A, D e E), vitamina B2 (vitamina hidrossolúvel), MPLA (monofosforil lipídio A, produzido pelo Instituto Butantan como subproduto da vacina pertussis low) e gel de hidróxido de alumínio. Para tanto, foram avaliadas a resposta imune conferida a camundongos BALB/c após imunização com diferentes formulações de vacina influenza (fragmentada e inativada) adjuvada e a existência, ou não, de toxicidade induzida pelas formulações vacinais estudadas. As formulações vacinais mais promissoras farão parte das formulações candidatas para realizações de ensaios clínicos. Os animais foram imunizados por via intraperitoneal com as formulações vacinais e foram colhidas amostras de sangue para ensaios sorológicos (inibição de hemaglutinação e ELISA) e células esplênicas para avaliação celular (dosagem de citocinas por citometria de fluxo: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17 TNF-α e INF-γ). Além disso, em um dos experimentos avaliou-se a formação de memória imunológica contra influenza, parâmetro importante em se pensando em uma vacina. Os três primeiros experimentos foram uma triagem a partir da qual selecionaram-se as melhores formulações que foram testadas no último experimento. Nele foram avaliados além da indução de resposta imune a toxicidade e a memória imunológica. Todas as 23 formulações estudadas induziram resposta minimamente protetora nos animais, com exceção da formulação contendo apenas MPLA como adjuvante. As formulações que se mostraram mais promissoras continham além do gel de AI(OH)3 MPLA de B. pertussis ou vitamina B2. Isso sem considerar o tocoferol (vitamina E), que embora tenha apresentado bons resultados acabou preterido em decorrência de sua potencial relação com casos de narcolepsia descritos na literatura. O teste de memória foi capaz de demonstrar que essas formulações produzem resposta de memória imunológica duradoura. Assim, tem-se resultados promissores para novos estudos pré-clínicos e clínicos com a vacina influenza (fragmentada e inativada) sazonal (trivalente). / Influenza, also known as flu, is a viral infectious disease that infects a large number of people annually, being responsible by large morbidity and mortality rates. The etiologic agent is the Myxovirus influenzae, an enveloped virus with single-stranded RNA and negative polarity. Vaccination is the best way to prevent the virus infection; however, the production capacity of this vaccine is not sufficient to vaccinate the entire world population, especially in cases of pandemics. This project aimed to develop an adjuvanted influenza vaccine (split and inactivated), increasing the productive capacity of this vaccine in Instituto Butantan, which is estimated in approximately 40 million of doses by campaign. Influenza vaccines formulated with adjuvants can produce the same protective immunological response against the virus using less amount of antigen increasing the production capacity of this vaccine up to four times. Twenty-three adjuvants containing fat-soluble vitamins (vitamins A, D and E), vitamin B2 (water-soluble vitamin), MPLA (monophosphoryl lipid A, produced by Instituto Butantan as a byproduct of pertussis low vaccine production) and aluminum hydroxide gel were studied. An adjuvant similar to MF59® (Novartis adjuvant) containing squalene was used as control. The immune response elicited in BALB/c mice after immunization with the different formulations of the influenza vaccine and the existence or not of toxicity induced by the vaccines formulations were studied. The most promising formulation will be part of the candidate formulations of clinicai trials. The animais received the vaccine formulations intraperitoneally and at specific days blood samples were taken to serological tests (hemagglutination inhibition and ELISA). At the end, they were euthanized to collect the spleens and splenic cells were cultivated to evaluate cytokines by flow cytometry: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17 TNF-α and INF-γ. Furthermore, in one experiment the immunological memory against influenza was evaluated, an important parameter to vaccines. The most promising formulations contained besides to alum either B. pertussis MPLA or B2 vitamin. Tocopherol (vitamin E) presented good results too, however it has a potential relationship with reported cases of narcolepsy. The memory test was able to demonstrate that these formulations induced long lasting immune memory response. Thus, these are promising results for new pre-clinical and clinical trials with seasonal trivalent influenza vaccine (split and inactivated).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29092015-121836 |
| Date | 20 March 2015 |
| Creators | Freitas, Fabio Alessandro de |
| Contributors | Quintilio, Wagner |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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