Die für Pflanzen lebenswichtige Synthese von Tetrapyrrolen bedarf einer fein justierten Anpassung an die Umweltbedingungen und erfolgt auf transkriptioneller und post-translationaler Ebene. In den Chloroplasten hat sich die Regulation von Enzymen über ihren Redox-Status als probates Mittel zur Koordination der photosynthetischen Energiegewinnung und des Metabolismus erwiesen. Die bei der Photosynthese generierten Reduktionsäquivalente werden zum Teil über die Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase auf eine Vielzahl plastidärer Thioredoxine (TRX) übertragen, welche Disulfidbrücken ihrer Zielproteine reduzieren können. Unter den Enzymen der Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) wurden bisher mehrere TRX-Interaktionspartner identifiziert, darunter die Glutamyl-tRNA-Reduktase (GluTR) und die 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase (ALAD). In Arabidopsis Mutanten, in denen die NADPH-abhängige Thioredoxin-Reduktase (NTRC) oder f- und m-Typ-TRX fehlen, konnten verringerte Chlorophyll- und Hämgehalte beobachtet werden. Diese ließen sich auf die verringerte Stabilität verschiedener TBS-Enzyme in den Mutanten zurückführen, darunter auch die GluTR und ALAD. Die Relevanz der Cysteine (Cys, C) für die Regulation der GluTR1-Stabilität wurde in vivo über transgene Arabidopsis Cys➔Serin (Ser, S)-Substitutionslinien untersucht. Dabei erwies sich GluTR1(C464S) stärker vor dem Abbau über die kaseinolytische Protease (Clp) geschützt als das WT-Protein. Eine intermolekulare Disulfidbrücke zwischen den beiden Cys464-Resten des GluTR1-Homodimers wird daher als Abbausignal postuliert. Mit Hilfe der rekombinanten ALAD1(Cys➔Ser)-Substitutionsmutanten konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Stabilität, sondern auch die Aktivität der ALAD1 in vitro vom Redox-Status des Enzyms abhängig ist. Die ALAD1(Cys➔Ser)-Substitutionsmutanten konnten über Enzymaktivitäts- und gel shift-Assays unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen zur Identifizierung der redox-sensitiven Cys beitragen. / The synthesis of tetrapyrroles, such as chlorophyll, is vital for plants and requires a finetuned regulation. The control mechanisms involved in tetrapyrrole biosynthesis (TBS) take place both on transcriptional and post-translational levels. A broadly spread post-translational regulatory mechanism in the chloroplast involves the reduction of inter- or intramolecular disulfide bonds of redox-sensitive target enzymes by thioredoxins (TRX). Thereby the coupling of photosynthetic energy production with several energy-consuming metabolic processes can be accomplished. The reduction of disulfide bonds in redox-sensitive enzymes was previously shown to lead usually to their activation. Regarding the TBS, several TRX interacting proteins have been identified, including glutamyl-tRNA-reductase (GluTR) as well as the 5-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD). Through the detailed and combined analysis of mutants with deficient NADPH-dependent thioredoxin reductase C (NTRC), TRX-f and TRX-m, a correlation became evident between decreased chlorophyll and heme levels of the mutants and lower amounts of several TBS enzymes, including GluTR and ALAD. For GluTR1, transgenic Arabidopsis cysteine (Cys, C) ➔ serine (Ser, S) substitution lines were generated and analyzed to identify the redox-sensitive Cys residues in vivo. In these studies, GluTR1(C464S) was shown to be better protected from degradation by the caseinolytic protease (Clp) than the GluTR1 WT protein. Thus, an intermolecular disulfide bond between the Cys464 residues in the dimerization domain of the GluTR1 homodimer is postulated to serve as a degradation signal under oxidizing conditions. However, it was shown by activity- and gel shift-assays with recombinant ALAD1(Cys➔Ser) substitution mutants that not only the stability, but also the in vitro activity of ALAD1 depends on the enzyme's redox state. Redox-sensitive inter- and intramolecular disulfide bridges of ALAD1 were identified among Cys71, Cys152 and Cys251.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/25015 |
| Date | 22 March 2022 |
| Creators | Wittmann, Daniel Thomas |
| Contributors | Grimm, Bernhard, Buckhout, Thomas, Geigenberger, Peter |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-ND 4.0) Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
Page generated in 0.0028 seconds