Tesis para optar al grado de Doctora en Ciencias con mención en Microbiología / Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza carotenoides, siendo el principal de ellos astaxantina. Esta característica la hace de gran interés comercial y objeto de numerosos estudios; sin embargo, existen muchos aspectos desconocidos relacionados con los mecanismos de regulación transcripcional del proceso de carotenogénesis. Estudios recientes proponen la participación del ergosterol, principal esterol en levaduras, en la regulación de genes carotenogénicos y otros esenciales en la vía del mevalonato. En este aspecto, se ha demostrado en otros hongos que el mecanismo por el que el ergosterol regula la transcripción génica es mediante la vía SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein). El factor transcripcional Sre1 posee el dominio activador de la transcripción en el amino terminal (Sre1N) y su activación ocurre cuando bajan los niveles de esteroles y/u oxígeno en la célula regulando la transcripción de genes involucrados en la biosíntesis de esteroles y respuesta a hipoxia, entre otros. El objetivo general de este trabajo fue estudiar el mecanismo de regulación de la expresión génica mediada por la vía SREBP dependiente de los niveles de ergosterol y oxígeno en la biosíntesis de carotenoides y esteroles en X. dendrorhous, enfocándose en la función del regulador transcripcional Sre1.
En primer lugar, se identificaron y caracterizaron bioinformaticamente posibles genes de la vía SREBP: SRE1, SCP1, STP1 y OFD1 de X. dendrorhous. Para estudiar la funcionalidad del gen SRE1, se construyó mutantes por deleción de este gen: CBS.sre1- y CBS.cyp61-/sre1- que provienen de las cepas parentales CBS 6938 y CBS.cyp61- (esta última no produce ergosterol), respectivamente. Además, se construyó la cepa mutante CBS.gSRE1N, que expresa sólo el dominio activador de la transcripción (Sre1N). Se evaluó el fenotipo de estas cepas en cuanto a la producción de esteroles y carotenoides, crecimiento en presencia de un inhibidor de la síntesis de esteroles (clotrimazol) y la expresión a nivel de transcritos de algunos genes. Como resultado, se observó que la deleción del gen disminuye la producción de ambos tipos de metabolitos y además, SRE1 es esencial para el crecimiento en clotrimazol. Adicionalemente, la cepa CBS.gSRE1N produce doble cantidad de carotenoides y esteroles, respecto a la cepa silvestre.
Paralelamente, se realizó un ensayo de complementación heteróloga vía expresión del gen SRE1 de X. dendrorhous en una cepa mutante sre1- de Schizosaccharomyces pombe y se observó que existe una complementación parcial, dado que la cepa complementada presenta un mejor crecimiento en anaerobiosis y cloruro de cobalto, respecto al control sre1-.
Por otra parte, se realizaron análisis transcriptómicos de las cepas mutantes en condiciones de normoxia, hipoxia y cloruro de cobalto, dado que este último compuesto se ha descrito como un agente que imita las condiciones de hipoxia. De estos análisis se desprende que Sre1 es necesario para la respuesta a hipoxia y que el cloruro de cobalto imitaría esta respuesta transcripcional en la levadura al menos en algunos genes de la biosíntesis de esteroles.
Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio se concluyó que el gen SRE1 identificado en X. dendrorhous es funcional y participa en la regulación de la biosíntesis de esteroles y carotenoides. / Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes carotenoids, mainly astaxanthin, this characteristic is of great commercial interest and subject of numerous studies. However, there are many unknown aspects related to transcriptional regulation mechanisms of carotenogenesis. Recent studies propose that ergosterol, the main sterol in yeast, is involved in the regulation of carotenogenic genes expression and on other genes of the mevalonate pathway. In this aspect, in other fungi it has been demonstrated that the mechanism by which ergosterol regulates gene transcription is through the SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein) pathway. The transcriptional factor Sre1 contains a transcriptional activation domain at its amino terminal end (Sre1N) that is activated when cellular sterols and/or oxygen levels decrease and by this way, it regulates the transcription of genes involved in the biosynthesis of sterols and response to hypoxia, among others. The general goal of this work was to study if this mechanism, the SREBP pathway, regulates the biosynthesis of carotenoids and sterols in X. dendrorhous, focusing on the function of the transcriptional regulator Sre1.
First, X. dendrorhous potential genes of the SREBP pathway, SRE1, SCP1, STP1 and OFD1, were identified and bioinformatically characterized. To study the functionality of the SRE1 gene, deletion mutants of this gene were constructed: CBS.sre1- and CBS.cyp61- / sre1- that derived from the parental strains CBS 6938 and CBS.cyp61- (which does not produce ergosterol), respectively. In addition, the mutant strain CBS.gSRE1N was generated, which expresses only the transcription activating domain (Sre1N). The phenotype of these strains was evaluated in relation to sterol and carotenoids production, growth in the presence of sterol synthesis inhibitor (clotrimazole) and transcript level of some genes. As a result, it was observed that the SRE1 gene deletion, decreases the production of both types of metabolites and also this gene is essential for growth in the presence of clotrimazole. In addition, the production of carotenoids and sterols in the CBS.gSRE1N strain was increased 2-fold compared to the wild-type strain.
In parallel, a heterologous complementation assay was performed by expressing the X. dendrorhous SRE1 gene in a Schizosaccharomyces pombe sre1- mutant strain. Partial complementation was observed as the complemented strain displayed better growth in anaerobiosis and in the presence of cobalt chloride (an agent that imitates hypoxia conditions), regarding to the controls strains.
On the other hand, transcriptomic analyses of the mutant strains were carried out in conditions of normoxia, hypoxia and cultures in the presence of cobalt chloride. In general, it was observed that Sre1 is necessary for the response to hypoxia conditions and that cobalt chloride would imitate these conditions in the transcriptional response in the yeast, at least in some genes of the sterol biosynthesis.
In conclusion, the SRE1 gene identified in X. dendrorhous is functional and it is involved in the regulation of the biosynthesis of sterols and carotenoids in this yeast. / Beca Doctoral y Proyecto FONDECYT 1160202. / 20 de febrero 2020.
Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/164000 |
Date | 01 1900 |
Creators | Gutiérrez Gutiérrez, María Soledad |
Contributors | Alcaíno Gorman, Jennifer, Martínez Fernández, Claudio, Cabrera Paucar, Ricardo, Chávez., Francisco, Vásquez, Claudio, Universidad de Chile. Escuela de Postgrado |
Publisher | Universidad de Chile |
Source Sets | Universidad de Chile |
Language | Spanish |
Detected Language | Spanish |
Type | Tesis |
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