Im urbanen Abwasser findet sich eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen, welche ein Risiko für Tier, Mensch und Umwelt darstellen. Um die Integration dieser und vieler weiterer Schadstoffe in den öffentlichen Wasserkreislauf zu verhindern, ist deren Eliminierung durch Klärwerke und die Überwachung dieser Abläufe von besonderer Relevanz. Obwohl die Präsenz mikrobiologischer Parameter dabei bisher lediglich akzessorisch betrachtet wird, sollten besonders Zoonosen im Abwasser aufgrund ihrer hohen Gesundheitsgefahr für Tiere und Menschen Beachtung in den vorgeschriebenen Kontrollen finden. Hierfür eignen sich besonders molekularbiologische Methoden, wie beispielsweise die zeiteffiziente real-time PCR, welche eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Eine Grundvoraussetzung für diesen DNA-basierten Pathogennachweis ist eine schnelle und effiziente Nukleinsäuren-Extraktion am Point-of-Need. Viele existierende Extraktionsverfahren werden diesem Anspruch jedoch aufgrund zeitintensiver und komplexer Protokolle nicht gerecht.
Ziel dieser Studie war es, eine Extraktionsmethode für mikrobielle DNA aus Abwasser zu entwickeln, mit welcher Pathogene mittels molekularer Detektionsmethoden wie beispielsweise real-time PCR nachgewiesen werden können.
Die Extraktion der DNA des grampositiven Bakteriums S. aureus, des gramnegativen Bakteriums E. coli und des Parasiten C. parvum basierte auf einer „Reverse Purification“. Um einen effizienten Zellaufschluss und DNA-Nachweis zu garantieren, wurde das Verfahren um a) mechanische (Bead Beating), b) chemische (alkalische Inkubation bei Raumtemperatur oder 95 °C) und/oder c) enzymatische (Proteinase K) Vorbehandlungen ergänzt. Das Bead Beating-Protokoll wurde anschließend durch die Variation der Kugelgrößen und den Einsatz von Vortexer oder Hulamixer anstelle eines komplexen Bead Beaters adaptiert. Mithilfe einer Verdünnungsreihe der Pathogene in experimentell kontaminiertem Abwasser wurde das Detektionslimit bestimmt und bei 95 %-iger Wahrscheinlichkeit durch das Wilrich&Wilrich Modell kalkuliert. Zusätzlich dazu wurden die Nukleinsäurekonzentrationen der einzelnen Protokolle mittels NanodropTM (Spektralphotometer) und QubitTM (Fluorometer) gemessen. Die Resultate wurden denen einer Silica-Säulen-basierten Referenzmethode gegenübergestellt.
Die effizienteste Methode zum Zellaufschluss der Bakterien steigerte die Extraktionseffizienz gegenüber der Referenzmethode um das Vierfache und beinhaltete eine Kombination aus Bead Beating (mit 0,1mm Glaskugeln und einem Vortexer) und Proteinase K bei 60°C für 10 Minuten. Im Fall von C. parvum erwies sich Proteinase K als effektivste Vorbehandlung (siebenfacher Anstieg der Extraktionsmenge). Basierend auf der etablierten Extraktionsmethode wurde bis zu 0,74 Zellen pro Reaktion von S. aureus, 9,94 Zellen von E. coli und 13,55 Oozysten von C. parvum in experimentell kontaminiertem Abwasser extrahiert und detektiert. Zwischen den detektierten Nukleinsäurekonzentrationen und den ermittelten Extraktionseffizienzen in der real-time PCR wurde keine Korrelation festgestellt.
Zur Extraktion mikrobieller DNA aus Abwasser wurde eine Methode für grampositive Bakterien (S. aureus), gramnegative Bakterien (E. coli) und Protozoen (C. parvum) entwickelt, welche eine schnelle und sensitive Erregerdetektion mittels real-time PCR garantiert. Diese Vorteile ermöglichen ein mobil einsetzbares Abwassermonitoring am Point-of-Need.:1 EINLEITUNG
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Mikrobielle Risiken im Abwasser
2.1.1 Staphylococcus aureus
2.1.2 Escherichia coli
2.1.3 Cryptosporidium parvum
2.2 Ablauf der Abwasseraufbereitung in Deutschland
2.3 Abwassermonitoring
2.3.1 Aktuelle Gesetzeslage und Empfehlungen
2.3.2 Zusätzliche Einsatzmöglichkeiten
2.4 Nachweismethoden im Abwasser: der Vergleich zwischen Kultur und real-time PCR
2.5 Extraktionsverfahren mikrobieller DNA
2.5.1 Konventionelle Extraktionsverfahren
2.5.2 Festphasen-Nukleinsäurenextraktion
3 PUBLIKATION
3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil der Publikation
3.2 Publikation
4 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNG
5 ZUSAMMENFASSUNG
6 SUMMARY
7 REFERENZEN
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
9 TABELLENVERZEICHNIS
10 ANHANG
11 DANKSAGUNG
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:87980 |
| Date | 13 November 2023 |
| Creators | Schurig, Sarah |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.3390/microorganisms11030813 |
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