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Previous issue date: 2002-02-28 / The characterization of the plasmid pLK39.was the aim of work.pLK39 was isolated from a
endophytic Gram-negative, bactéria isolated from leaves form Solanum lycocarpum
(Lobeira). In order to obtain a selection marker which would characterization in Escherichia
coli the kanamycin, resistence gene from pUC4K. was subcloned into the PstIsite of pLK39.
The characterization of PLK39 was basedon studies of stability, incompatibility,
determination of the copy number and through DNA sequencing. The stability was carried out
in Escherichia coli XL10 cells. Cells transformed with pLK39 were inoculated in Lúria broth
containing Kanamycin (50μg/ml) during24 hours. After 24 hours of incubation one sample of
the culture was in medim with and without selective pressure, and inoculated in Lúria broth
without pressure médium, for 240 generations. After 240 generations 81,5% of cells
maintained the plasmid, showing that pLK39is highly stable in Escherichia coli to make the
incompatibility test, cells of Escherichia coli XL10 were co-transformed with pLK39/pUC18;
pBR322 and pLK39/pACYC184. After 240 generations, the plasmid pLK39 iof detected in
all systems used, showing the compatibility of pLK39 with the plasmids tested. The copý
number pLK39 was estimated by the intensity of plasmidial bands in agarose gel,
electrophoresis using a photodocumentation and analysis system (KODAK EDAS). The copý
number of pLK39 was estimated as 25 copies per cell. PLK39 was digested with Sau3AI
restriction and subcloned into the BamHI site of plasmid pUC18. The recombinant clones
were sequenced and 1637 pb reading fragment was obtained. This sequence showed high
homology with pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 and pBERT, which were isolated from
Gram-negative bacteria. This sequence possesses two possible genes. The ORF I showed high
homology with mobB gene from plasmid pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%),
pUCD5000 (94%) and pBERT (87%). The ORF II showed homology with mobD gene from
plasmids pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) and PUCD5000 (89%). / O objetivo deste trabalho foi caracterizar o plasmídeo pLK39. Este plasmídeo foi extraído de
uma bactéria endofítica Gram-negativa, isolada da folha de Solanum Lycocarpum (Lobeira).
Este plasmídeo apresenta um tamanho de aproximadamente 4,5 kb. Visando obter uma marca
de seleção para permitir sua caracterização em células de Escherichia coli, foi introduzido o
gene de resistência à Kanamicina, extraído do plasmídeo pUC4K. A caracterização do pLK39
foi realizada através de estudos de estabilidade, incompatibilidade, estimativa do número de
cópias e através de seqüenciamento de parte do plasmídeo. A estabilidade foi testada em
células de Escherichia coli XL10. Células transformadas com pLK39 foram cultivadas em
meio Lúria suplementado com Kanamicina (50 μg/mL) durante 24 horas uma amostra da
cultura era plaqueada em meio seletivo e em meio sem pressão seletiva parte dessa amostra
foi inoculada em meio Lúria sem pressão seletiva e incubado por 24 até atingir 240 gerações.
Após 240 gerações 81.5% das células mantiveram o plasmídeo, mostrando que o pLK39 é
bastante estável em células de Escherichia coli. Para realização do teste de incompatibilidade,
células de Escherichia coli XL10 foram co-transformadas com os plasmídeos pLK39/pUC18,
pLK39/pBR322 e pLK39/pACYC184. Após 240 gerações, foi detectada a presença do
plasmídeo pLK39 em todos os sistemas testados, demonstrando a compatibilidade do pLK39
com os plasmídeos testados. O número de cópias do pLK39 foi estimado através da
comparação da intensidade das bandas plasmidiais, obtidas através de eletroforese em gel de
agarose, realizada a partir de uma extração de plasmídeos de células de Escherichia coli XL10
transformadas com pUC18, pBR322 e pLK39. A quantificação de cada banda foi realizada
utilizando o sistema de fotodocumentação e analise (KODAK EDAS). O número de cópias do
pLK39 foi estimado em 25 cópias por células. O plasmídeo pLK39 foi digerido com enzima
de restrição Sau3AI e sub-clonado no sítio de BamHI do plasmídeo pUC18. Os clones
recombinantes foram seqüenciados. Foi obtido um fragmento com 1.637 pb. Essa seqüência
apresentou uma grande homologia com os plasmídeos pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000
e pBERT, os quais foram isolados de diferentes bactérias Gram-negativas. A seqüência
apresentou dois possíveis genes. A ORF I apresentou grande homologia com o gene mobB
dos plasmídeos pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) e pBERT
(87%). A ORF II apresentou homologia com o gene mobD dos plasmídeos pSW200 (92%),
pSW100 (90%), pEC3 (90%) e PUCD5000 (89%).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tde/1287 |
| Date | 28 February 2002 |
| Creators | OLIVEIRA, Vera Lúcia Cardoso de |
| Contributors | BATAUS, Luiz Artur Mendes |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Mestrado em Biologia, UFG, BR, Ciências Biolóicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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