A presença de plasmídeos conjugativos como IncP, IncU e IncFII carreando genes de resistência em Pseudomonas aeruginosa é de grande importância, pois podem ser trocados entre diferentes bactérias gram-negativas, disseminando a resistência aos antibióticos. Conhecer estes genes de resistência bem como os elementos genéticos que os carreiam é importante para entender os fatores que contribuem para a disseminação da resistência, auxiliando no controle da disseminação da resistência aos antibióticos. Ainda hoje não existe esquema para a tipagem de plasmídeos de P. aeruginosa, e são encontrados poucos trabalhos sobre estes plasmídeos. O objetivo deste estudo foi identificar os genes de resistência a antibióticos, o ambiente genético em que estes genes estão inseridos e a clonalidade dos isolados produtores de genes bla. No período do estudo, foram estudados 293 isolados de P. aeruginosa resistentes às cefalosporinas de 3ª e/ou 4ª gerações e/ou aos carbapenêmicos isoladas de pacientes de hospitais de Ribeirão Preto-SP, Belo Horizonte-MG, Franca-SP, Cuiabá-MT, de Barretos-SP e de Rio Branco-AC. Genes de resistência foram pesquisados por PCR. O perfil clonal dos isolados produtores de genes bla foi determinado por PFGE e MLST. A tipagem de plasmídeos foi feita por PFGE-S1 nuclease, hibridações com sondas específicas e tipagem de replicons (PBRT). Foram identificados 12 isolados carreando o gene blaSPM-1, 16 isolados carreando o gene blaCTX-M-2 e 3 isolados carreando o gene blaKPC-2. Em todos os 12 isolados produtores de SPM-1 foram identificadas duas cópias do elemento de inserção ISCR4, sendo uma cópia upstream e uma cópia downstream ao gene blaSPM-1 inseridos no cromossomo bacteriano. Em 13 dos 16 isolados produtores de CTX-M-2 o gene blaCTX-M-2 foi encontrado associado ao elemento de inserção ISCR1 e em 3 ao elemento de inserção ISEcp1 também inseridos no cromossomo bacteriano. Em 2 isolados o gene blaKPC-2 é carreado por um plasmídeo de ~3kb não tipável por PBRT e um em está inserido no cromossomo bacteriano. O ambiente genético do gene blaKPC-2 nos isolados estudados é diferente daqueles encontrados na literatura. Os isolados produtores de genes bla citados apresentaram diversidade clonal, tanto por PFGE quanto MLST demonstrando que vários clones estão envolvidos na disseminação desses genes. Este trabalho identificou e caracterizou 31 isolados produtores de ?-lactamases, o ambiente genético destes genes e a clonalidade de isolados de várias cidades do Brasil e em períodos diferenciados, demonstrando a disseminação desses genes em diferentes hospitais brasileiros. Esses dados auxiliam no conhecimento dos fatores que estão envolvidos na disseminação da resistência aos antibióticos e podem auxiliar as CCIHs dos hospitais a definirem estratégias para controlar a disseminação desses microrganismos prevenindo surtos de bactérias multirresistentes. / The presence of conjugative plasmids as IncP, IncU and Inc FII carrying resistance genes in Pseudomonas aeruginosa is very important because t these plasmids can be shared among different bacteria, spreading antibiotic resistance. Knowledge of these genes as well as genetic elements carrying these genes it is important to understend the factors that contribute to the spread of resistance, helping to control the spread of antibiotic resistance. Today there is no plasmid typing scheme to P. aeruginosa and few papers are found about this subject. The purpose of this study was to investigate resistance genes, genetic environment of these genes and clonal relationship of the isolates carrying these resistance genes. In the period of this study was studied 293 P. aeruginosa resistant to third and fourth generations of cephalosporins and/or carbapenens isolated of patients from hosptital from Ribeirão Preto, Belo Horizonte-MG, Franca-SP, Cuiabá-MT, Barretos-SP and Rio Branco-AC. Resistance genes were investigated by PCR. Twelve isolates were identified carrying blaSPM-1 gene, 16 isolates carrying blaCTX-M-2 gene and 3 isolates carrying blaKPC-2 gene. Clonal profiles of isolates producing resistance genes were investigated by PFGE and MLST. Plasmid typing was performed by PFGE-S1 nuclease, specific hybridizations and PCR replicon typing (PBRT). Two isolates presented a 3kb plasmid non-typeable by PBRT carrying blaKPC-2 gene. In all isolates SPM-1-producers were identified two copies of insertion sequence ISCR4, a copy upstream and a copy downstream to blaSPM-1 gene inserted in chromosomal DNA. In 13 of 16 isolates CTX-M-2-producers the blaCTX-M-2 gene was found associated to insertion sequence ISCR1 and in 3 isolates was associated to insertion sequence ISEcp1 also inserted in chromosomal DNA. Genetic environment of blaKPC-2 gene in the isolates studied it is different from those found in the literature. Isolates producing bla genes are clonally diversified using both PFGE and MLST showing that various clones are responsible to spread these resistance genes. This work identified and characterized 31 P. aeruginosa-?-lactamase-producing, the genetic environment of these genes and the clonal relationship of isolates collected from different periods from different cities of Brazil. These data can help us to understand the factors that are involved in the spread of antibiotics resistance and to help the Hospital Infection Control Committee to define strategies to control the spread of these microorganisms preventing outbreaks of resistant.

A produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) tornou-se um desafio em saúde pública por restringir as opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas. O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de estirpes produtoras de ESBL nas granjas de suínos brasileiras, bem como caracterizar os plasmídeos carreadores dos genes blaESBL quanto ao grupo de incompatibilidade, tamanho e presença de genes de resistência adicionais. As estirpes foram isoladas em meio MacConkey e identificadas por MALDI-TOF. Posteriormente, os valores de concentração inibitória mínima foram determinados por microdiluição e/ou ágar diluição para aminoglicosídeos, carbapenens, cefalosporinas, fluoroquinolonas, tetraciclinas, sulfas e cefalosporinas associadas a inibidores competitivos. Os genes codificadores de beta-lactamases foram identificados por PCR assim como o grupo de incompatibilidade dos respectivos plasmídeos carreadores e o grupo filogenético das estirpes de E. coli. A análise de clonalidade foi realizada por ERIC-PCR e MLST. Finalmente, o ambiente genético do gene blaCTX-M-15 foi determinado por PCR e/ou sequenciamento, sendo que os plasmídeos carreando genes blaESBL foram transferidos às estirpes receptoras E. coli TOP10 e C600 por transformação e conjugação, respectivamente, e parcialmente sequenciados. As estirpes de Escherichia coli produtoras de CTX-M-2 foram as mais prevalentes, sendo endêmicas no estado de Minas Gerais. Além disso, é relatada a presença da enzima CTX-M-15 em estirpes de E. coli (ST224, ST410, ST1284), Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa (ST3201). O gene blaCTX-M-15 esteve associado a plasmídeos IncF e foi transferido com sucesso para a estirpe receptora E.coli TOP10, plasmídeos IncF também foram associados a presença do gene blaCTX-M-2. O gene blaCTX-M-8 foi detectado em quatro novos STs de E. coli (ST5845, ST5847, ST5848 e ST5350) e não foi adquirido pelas estirpes receptoras. Estes dados indicam que a vigilância de fenótipos resistentes na produção suína deve de ser considerada uma prioridade, assim como a preferência ao uso de antimicrobianos de espectro estrito a fim de evitar a disseminação desses fenótipos nas granjas e sua possível transmissão para população humana. / Extended-spectrum beta-lactamase production (ESBL) became a great challenge regarding public health because limit the therapeutic options to treat infections by gram-negative bacteria. The aim of this study were evaluate the occurrence of ESBL producers in Brazilian swine farms and characterize blaESBL-carrying plasmids by sizing and incompatibility group and presence of additional resistance genes. Strains were isolated in MacConkey agar and identified by Maldi-Tof. Next, the minimal inhibitory concentration values were determined by microdilution and/or agar dilution to aminoglycosides, carbapenems, cephalosporins, fluoroquinolones, tetracyclines, sulfas and cephalosporin/inhibitors association. Betalactamase encoding genes, plasmid incompatibility group and Escherichia coli phylogenetic group were determined by PCR. Clonal relatedness was evaluated by ERIC-PCR and MLST. Finally, the blaCTX-M-15 genetic environment was determined by PCR and/or sequencing and blaESBL-carrying plasmids transferred to E. coli TOP10 and C600 receptor strains by transformation and conjugation, respectively, and partially sequenced. CTX-M-2-producing E. coli were the most prevalent phenotype, which were endemic in Minas Gerais State. Moreover, the CTX-M-15 enzyme emerged among E. coli (ST224, ST410, ST1284), Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa (ST3201) strains. The blaCTX-M-15 was associated with IncF plasmids, which were successfully transferred to E.coli TOP10, similarly, IncF plasmids were found harboring the blaCTX-M-2. The blaCTX-M-8, detected in four novel E. coli sequence types (ST5845, ST5847, ST5848 e ST5350), was not acquired by receptor strains. Thus, the surveillance of resistant phenotypes in swine production must be established as a priority as well as narrow spectrum antimicrobials prescription antimicrobial instead broad spectrum to prevent the dissemination of these phenotypes in farms and their transmission to human population.

A produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) tornou-se um desafio em saúde pública por restringir as opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas. O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de estirpes produtoras de ESBL nas granjas de suínos brasileiras, bem como caracterizar os plasmídeos carreadores dos genes blaESBL quanto ao grupo de incompatibilidade, tamanho e presença de genes de resistência adicionais. As estirpes foram isoladas em meio MacConkey e identificadas por MALDI-TOF. Posteriormente, os valores de concentração inibitória mínima foram determinados por microdiluição e/ou ágar diluição para aminoglicosídeos, carbapenens, cefalosporinas, fluoroquinolonas, tetraciclinas, sulfas e cefalosporinas associadas a inibidores competitivos. Os genes codificadores de beta-lactamases foram identificados por PCR assim como o grupo de incompatibilidade dos respectivos plasmídeos carreadores e o grupo filogenético das estirpes de E. coli. A análise de clonalidade foi realizada por ERIC-PCR e MLST. Finalmente, o ambiente genético do gene blaCTX-M-15 foi determinado por PCR e/ou sequenciamento, sendo que os plasmídeos carreando genes blaESBL foram transferidos às estirpes receptoras E. coli TOP10 e C600 por transformação e conjugação, respectivamente, e parcialmente sequenciados. As estirpes de Escherichia coli produtoras de CTX-M-2 foram as mais prevalentes, sendo endêmicas no estado de Minas Gerais. Além disso, é relatada a presença da enzima CTX-M-15 em estirpes de E. coli (ST224, ST410, ST1284), Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa (ST3201). O gene blaCTX-M-15 esteve associado a plasmídeos IncF e foi transferido com sucesso para a estirpe receptora E.coli TOP10, plasmídeos IncF também foram associados a presença do gene blaCTX-M-2. O gene blaCTX-M-8 foi detectado em quatro novos STs de E. coli (ST5845, ST5847, ST5848 e ST5350) e não foi adquirido pelas estirpes receptoras. Estes dados indicam que a vigilância de fenótipos resistentes na produção suína deve de ser considerada uma prioridade, assim como a preferência ao uso de antimicrobianos de espectro estrito a fim de evitar a disseminação desses fenótipos nas granjas e sua possível transmissão para população humana. / Extended-spectrum beta-lactamase production (ESBL) became a great challenge regarding public health because limit the therapeutic options to treat infections by gram-negative bacteria. The aim of this study were evaluate the occurrence of ESBL producers in Brazilian swine farms and characterize blaESBL-carrying plasmids by sizing and incompatibility group and presence of additional resistance genes. Strains were isolated in MacConkey agar and identified by Maldi-Tof. Next, the minimal inhibitory concentration values were determined by microdilution and/or agar dilution to aminoglycosides, carbapenems, cephalosporins, fluoroquinolones, tetracyclines, sulfas and cephalosporin/inhibitors association. Betalactamase encoding genes, plasmid incompatibility group and Escherichia coli phylogenetic group were determined by PCR. Clonal relatedness was evaluated by ERIC-PCR and MLST. Finally, the blaCTX-M-15 genetic environment was determined by PCR and/or sequencing and blaESBL-carrying plasmids transferred to E. coli TOP10 and C600 receptor strains by transformation and conjugation, respectively, and partially sequenced. CTX-M-2-producing E. coli were the most prevalent phenotype, which were endemic in Minas Gerais State. Moreover, the CTX-M-15 enzyme emerged among E. coli (ST224, ST410, ST1284), Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa (ST3201) strains. The blaCTX-M-15 was associated with IncF plasmids, which were successfully transferred to E.coli TOP10, similarly, IncF plasmids were found harboring the blaCTX-M-2. The blaCTX-M-8, detected in four novel E. coli sequence types (ST5845, ST5847, ST5848 e ST5350), was not acquired by receptor strains. Thus, the surveillance of resistant phenotypes in swine production must be established as a priority as well as narrow spectrum antimicrobials prescription antimicrobial instead broad spectrum to prevent the dissemination of these phenotypes in farms and their transmission to human population.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-11T13:47:24Z No. of bitstreams: 2 Tese Danielly Ferreira.pdf: 18104050 bytes, checksum: d3cdc17b1aa66d984ed1e66717abf7f1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Danielly Ferreira.pdf: 18104050 bytes, checksum: d3cdc17b1aa66d984ed1e66717abf7f1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-07-28 / CAPES; FACEPE; CNPq / Infecções pelo papilomavírus humano (HPV) de alto risco, principalmente o HPV16, podem levar ao desenvolvimento de tumores, como o de câncer cervical. O diagnóstico rápido e preciso associado a uma baixo custo operacional das lesões pré-cancerígenas por HPV é extremamente importante para o sucesso do tratamento. Os tradicionais testes para o diagnóstico desse vírus não preenchem todos os requisitos necessários para um diagnóstico bem sucedido. Dispositivos analíticos, como os biossensores, podem detectar agentes infecciosos de uma maneira mais simples e barata, em comparação com os testes convencionais. Estas características tornam os biossensors uma alternativa promissora para o diagnóstico precoce do HPV. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de genossensores (biossensores de DNA) para o diagnóstico do HPV. O primeiro biossensor foi composto de dois eletrodos, um eletrodo de trabalho (ET) feito de lápis grafite e um eletrodo de referência (ER) feito de Ag/AgCl. O outro modelo de biossensor foi formado por três eletrodos impressos: ET constituído de ouro; ER constituído de Ag/AgCl; e EA (eletrodo auxiliar) constituído de carbono. Nos dois biossensores propostos, um sonda de DNA específica para o gene E6 do HPV16 foi imobilizada sob o eletrodo de trabalho por adsorção e, em seguida, uma sequência alvo foi hibridizada com a sonda imobilizada. No primeiro biossensor, o alvo foi o gene E6 do HPV16 colonado no plasmíedo PGEM-T. Já no segundo biossensor, os alvos foram os oligonucleotídicos sintéticos e o DNA extraído (DE) de amostras de pacientes. Os sinais redox da hibridização, nos dois biossensores, foram analisados pela técnica de voltametria de pulso diferencial. Os resultados mostraram que os biossensores puderam diferenciar a hibridização da não-hibridização. Os dois biossensores propostos apresentaram elevada sensibilidade cujos limites de detecção foram para o primeiro biossensor de 16 pg/μL (7 nM) e o segundo biossensor de 18,13 nM. Além disso, ao contrário dos testes padrão, os dois genossensores foram capazes de detectar a presença do DNA viral sem a necessidade de amplificação do material genético. Isso os tornam mais rápidos e baratos em comparação aos testes convencionais. Os dados obtidos com os biossensores mostraram viabilidade para o diagnóstico de vários tipos de HPVs, permitindo com isso o desenvolvimento de um sistema pioneiro para detecção portátil desse vírus.

A presença de plasmídeos conjugativos como IncP, IncU e IncFII carreando genes de resistência em Pseudomonas aeruginosa é de grande importância, pois podem ser trocados entre diferentes bactérias gram-negativas, disseminando a resistência aos antibióticos. Conhecer estes genes de resistência bem como os elementos genéticos que os carreiam é importante para entender os fatores que contribuem para a disseminação da resistência, auxiliando no controle da disseminação da resistência aos antibióticos. Ainda hoje não existe esquema para a tipagem de plasmídeos de P. aeruginosa, e são encontrados poucos trabalhos sobre estes plasmídeos. O objetivo deste estudo foi identificar os genes de resistência a antibióticos, o ambiente genético em que estes genes estão inseridos e a clonalidade dos isolados produtores de genes bla. No período do estudo, foram estudados 293 isolados de P. aeruginosa resistentes às cefalosporinas de 3ª e/ou 4ª gerações e/ou aos carbapenêmicos isoladas de pacientes de hospitais de Ribeirão Preto-SP, Belo Horizonte-MG, Franca-SP, Cuiabá-MT, de Barretos-SP e de Rio Branco-AC. Genes de resistência foram pesquisados por PCR. O perfil clonal dos isolados produtores de genes bla foi determinado por PFGE e MLST. A tipagem de plasmídeos foi feita por PFGE-S1 nuclease, hibridações com sondas específicas e tipagem de replicons (PBRT). Foram identificados 12 isolados carreando o gene blaSPM-1, 16 isolados carreando o gene blaCTX-M-2 e 3 isolados carreando o gene blaKPC-2. Em todos os 12 isolados produtores de SPM-1 foram identificadas duas cópias do elemento de inserção ISCR4, sendo uma cópia upstream e uma cópia downstream ao gene blaSPM-1 inseridos no cromossomo bacteriano. Em 13 dos 16 isolados produtores de CTX-M-2 o gene blaCTX-M-2 foi encontrado associado ao elemento de inserção ISCR1 e em 3 ao elemento de inserção ISEcp1 também inseridos no cromossomo bacteriano. Em 2 isolados o gene blaKPC-2 é carreado por um plasmídeo de ~3kb não tipável por PBRT e um em está inserido no cromossomo bacteriano. O ambiente genético do gene blaKPC-2 nos isolados estudados é diferente daqueles encontrados na literatura. Os isolados produtores de genes bla citados apresentaram diversidade clonal, tanto por PFGE quanto MLST demonstrando que vários clones estão envolvidos na disseminação desses genes. Este trabalho identificou e caracterizou 31 isolados produtores de ?-lactamases, o ambiente genético destes genes e a clonalidade de isolados de várias cidades do Brasil e em períodos diferenciados, demonstrando a disseminação desses genes em diferentes hospitais brasileiros. Esses dados auxiliam no conhecimento dos fatores que estão envolvidos na disseminação da resistência aos antibióticos e podem auxiliar as CCIHs dos hospitais a definirem estratégias para controlar a disseminação desses microrganismos prevenindo surtos de bactérias multirresistentes. / The presence of conjugative plasmids as IncP, IncU and Inc FII carrying resistance genes in Pseudomonas aeruginosa is very important because t these plasmids can be shared among different bacteria, spreading antibiotic resistance. Knowledge of these genes as well as genetic elements carrying these genes it is important to understend the factors that contribute to the spread of resistance, helping to control the spread of antibiotic resistance. Today there is no plasmid typing scheme to P. aeruginosa and few papers are found about this subject. The purpose of this study was to investigate resistance genes, genetic environment of these genes and clonal relationship of the isolates carrying these resistance genes. In the period of this study was studied 293 P. aeruginosa resistant to third and fourth generations of cephalosporins and/or carbapenens isolated of patients from hosptital from Ribeirão Preto, Belo Horizonte-MG, Franca-SP, Cuiabá-MT, Barretos-SP and Rio Branco-AC. Resistance genes were investigated by PCR. Twelve isolates were identified carrying blaSPM-1 gene, 16 isolates carrying blaCTX-M-2 gene and 3 isolates carrying blaKPC-2 gene. Clonal profiles of isolates producing resistance genes were investigated by PFGE and MLST. Plasmid typing was performed by PFGE-S1 nuclease, specific hybridizations and PCR replicon typing (PBRT). Two isolates presented a 3kb plasmid non-typeable by PBRT carrying blaKPC-2 gene. In all isolates SPM-1-producers were identified two copies of insertion sequence ISCR4, a copy upstream and a copy downstream to blaSPM-1 gene inserted in chromosomal DNA. In 13 of 16 isolates CTX-M-2-producers the blaCTX-M-2 gene was found associated to insertion sequence ISCR1 and in 3 isolates was associated to insertion sequence ISEcp1 also inserted in chromosomal DNA. Genetic environment of blaKPC-2 gene in the isolates studied it is different from those found in the literature. Isolates producing bla genes are clonally diversified using both PFGE and MLST showing that various clones are responsible to spread these resistance genes. This work identified and characterized 31 P. aeruginosa-?-lactamase-producing, the genetic environment of these genes and the clonal relationship of isolates collected from different periods from different cities of Brazil. These data can help us to understand the factors that are involved in the spread of antibiotics resistance and to help the Hospital Infection Control Committee to define strategies to control the spread of these microorganisms preventing outbreaks of resistant.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vera.pdf: 2531477 bytes, checksum: 5a02810a0fd91027af8891fb7a147973 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / The characterization of the plasmid pLK39.was the aim of work.pLK39 was isolated from a endophytic Gram-negative, bactéria isolated from leaves form Solanum lycocarpum (Lobeira). In order to obtain a selection marker which would characterization in Escherichia coli the kanamycin, resistence gene from pUC4K. was subcloned into the PstIsite of pLK39. The characterization of PLK39 was basedon studies of stability, incompatibility, determination of the copy number and through DNA sequencing. The stability was carried out in Escherichia coli XL10 cells. Cells transformed with pLK39 were inoculated in Lúria broth containing Kanamycin (50μg/ml) during24 hours. After 24 hours of incubation one sample of the culture was in medim with and without selective pressure, and inoculated in Lúria broth without pressure médium, for 240 generations. After 240 generations 81,5% of cells maintained the plasmid, showing that pLK39is highly stable in Escherichia coli to make the incompatibility test, cells of Escherichia coli XL10 were co-transformed with pLK39/pUC18; pBR322 and pLK39/pACYC184. After 240 generations, the plasmid pLK39 iof detected in all systems used, showing the compatibility of pLK39 with the plasmids tested. The copý number pLK39 was estimated by the intensity of plasmidial bands in agarose gel, electrophoresis using a photodocumentation and analysis system (KODAK EDAS). The copý number of pLK39 was estimated as 25 copies per cell. PLK39 was digested with Sau3AI restriction and subcloned into the BamHI site of plasmid pUC18. The recombinant clones were sequenced and 1637 pb reading fragment was obtained. This sequence showed high homology with pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 and pBERT, which were isolated from Gram-negative bacteria. This sequence possesses two possible genes. The ORF I showed high homology with mobB gene from plasmid pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) and pBERT (87%). The ORF II showed homology with mobD gene from plasmids pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) and PUCD5000 (89%). / O objetivo deste trabalho foi caracterizar o plasmídeo pLK39. Este plasmídeo foi extraído de uma bactéria endofítica Gram-negativa, isolada da folha de Solanum Lycocarpum (Lobeira). Este plasmídeo apresenta um tamanho de aproximadamente 4,5 kb. Visando obter uma marca de seleção para permitir sua caracterização em células de Escherichia coli, foi introduzido o gene de resistência à Kanamicina, extraído do plasmídeo pUC4K. A caracterização do pLK39 foi realizada através de estudos de estabilidade, incompatibilidade, estimativa do número de cópias e através de seqüenciamento de parte do plasmídeo. A estabilidade foi testada em células de Escherichia coli XL10. Células transformadas com pLK39 foram cultivadas em meio Lúria suplementado com Kanamicina (50 μg/mL) durante 24 horas uma amostra da cultura era plaqueada em meio seletivo e em meio sem pressão seletiva parte dessa amostra foi inoculada em meio Lúria sem pressão seletiva e incubado por 24 até atingir 240 gerações. Após 240 gerações 81.5% das células mantiveram o plasmídeo, mostrando que o pLK39 é bastante estável em células de Escherichia coli. Para realização do teste de incompatibilidade, células de Escherichia coli XL10 foram co-transformadas com os plasmídeos pLK39/pUC18, pLK39/pBR322 e pLK39/pACYC184. Após 240 gerações, foi detectada a presença do plasmídeo pLK39 em todos os sistemas testados, demonstrando a compatibilidade do pLK39 com os plasmídeos testados. O número de cópias do pLK39 foi estimado através da comparação da intensidade das bandas plasmidiais, obtidas através de eletroforese em gel de agarose, realizada a partir de uma extração de plasmídeos de células de Escherichia coli XL10 transformadas com pUC18, pBR322 e pLK39. A quantificação de cada banda foi realizada utilizando o sistema de fotodocumentação e analise (KODAK EDAS). O número de cópias do pLK39 foi estimado em 25 cópias por células. O plasmídeo pLK39 foi digerido com enzima de restrição Sau3AI e sub-clonado no sítio de BamHI do plasmídeo pUC18. Os clones recombinantes foram seqüenciados. Foi obtido um fragmento com 1.637 pb. Essa seqüência apresentou uma grande homologia com os plasmídeos pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 e pBERT, os quais foram isolados de diferentes bactérias Gram-negativas. A seqüência apresentou dois possíveis genes. A ORF I apresentou grande homologia com o gene mobB dos plasmídeos pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) e pBERT (87%). A ORF II apresentou homologia com o gene mobD dos plasmídeos pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) e PUCD5000 (89%).

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lilian CARLA CARNEIRO Tese.pdf: 936824 bytes, checksum: e49c7ff122a0392ea9e5120fd05064ed (MD5) Previous issue date: 2010-05-31 / A small cryptic plasmid isolated from Salmonella enterica Enteritidis called pVCM04 was sequenced and characterizated. pVCM04 is a 3583 pb circle molecule that showed no homology with other plasmids deposited in the GenBank. 12 ORF with more than 50 aminoacids were predicted using the ORF finder program. ORF1 and ORF2 showed homology with replication proteins of different plasmids. ORF 3-5 showed homology with mobilization proteins present in several plasmids; the others seven ORF showed no homology with genes deposited in GenBank. The pVCM04 possess a region with more than 500 pb that is not associated with none of the predicted proteins. This region is organizated in a G+C rich, A+T rich and two repeat direct sequences. The second repeat direct sequence contains a region of DnaA box connection (TTTACAC). This region is probably associated to the replication origin theta type. The phylogenetic relationship among replicase and mobilization deduced protein showed highest similarity of replicase proteins than mobilization proteins. Conjugation experiments showed that the pVCM04/pUC18 fusion not have a good ability to transfer, the plasmid stability test showed that the cells lost 60% of pVCM04/pUC18 on the first day of cultivation. The characterization suggests that the pVCM04 probably would be a cryptic plasmid from fusion of different ancestral plasmid. / Um pequeno plasmídeo críptico isolado de Salmonella enterica Enteretidis denominado pVCM04 foi sequênciado e caracterizado. O pVCM04 é uma molécula circular com 3583 pb a qual não apresenta homologia com outros plasmídeos depositados no GenBank . 12 ORF ( Open Read Frame ) com mais de 50 aminoácidos foram preditas usando o programa ORFinder. A ORF1 e a ORF2 apresentaram homologia com proteínas de replicação de diferentes plasmídeos. As ORF 3, 4 e 5 apresentaram homologia com proteínas de mobilização presente em vários plasmídeos; as outras sete ORF não apresentaram homologia com genes depositados no GenBank . O pVCM04 possui uma região, com mais de 500 pb, que não está associada a nenhuma das proteínas preditas. Esta região está organizada em uma sequência rica em G+C, A+T e duas sequências repetidas diretas. A segunda sequência repetida direta contém uma sequência de ligação para a proteína DnaA (TTTACAC). Esta região está provavelmente associada com a origem de replicação do tipo theta. As relações filogenéticas para as proteínas deduzidas replicase e de mobilização mostraram maior similaridade para proteínas replicase do que para proteínas de mobilização. Experimentos de conjugação evidenciaram que a fusão pVCM04⁄pUC18 não possui uma boa capacidade de transferência; o teste de estabilidade plasmidial demonstrou que as células perdem 60% do pVCM04⁄pUC18 no primeiro dia de cultivo. A caracterização do pVCM04 sugere que este plasmídeo provavelmente seja um plasmídeo críptico oriundo de diferentes ancestrais.

Gracilariaceae is a worldwide distributed family that includes numerous economically important species. Currently, five genera are recognized in the Gracilariaceae: Gracilariophila (parasitic), Curdiea, Melanthalia, Gracilaria, and Gracilariopsis. Some species of Gracilaria were taxonomically transferred to Hydropuntia. However, this genus is quite controversial. High-throughput sequencing (HTS) techniques has led to an increase in studies using complete organellar genomes, which have been used to infer phylogenetic relationships in Rhodophyta and the investigation of other aspects of red algal genomes, including gene synteny and horizontal gene transfers (HGT). HTS also facilitated the search for extrachromosomal plasmids and its influence in the organellar genomes by HGT. We applied HTS to assemble and annotate organellar genomes (mitochondria and chloroplast) from seven species of Gracilariaceae using Illumina HiSeq 2500 platform. We also received raw reads of 31 samples of Gracilariaceae from Dr. Goia Lyra that were analysed and included in our work. We used these data, combined with published genomes, to infer phylogenies and compare the genome architecture of these species representing the main lineages in Gracilariaceae. The mitochondrial and chloroplast genomes were highly conserved in gene synteny among the species, and variation mainly occurred in regions where insertions of plasmid-derived sequences (PDSs) were found, which were similar to known red algae extrachromosomal plasmids. In mitochondrial genomes, the PDS insertions were in two regions where the transcription direction changes: between cob and trnL genes, and trnA and trnN genes. PDS insertions in chloroplast genome were in different positions, but generally found between psdD and rrs genes. The bacterial leuC/leuD operon was found in Gracilaria tenuistipitata, G. chilensis, M. intermedia chloroplasts genomes, and also in G. vermiculophylla extrachromosomal plasmid. Phylogenetic trees show two different origins of leuC/leuD: genes found in chloroplasts and plasmids were close to proteobacteria, and genes encoded in the nucleus are close to Viridiplantae and cyanobacteria. Gracilariaceae may be a good model to study the impact of PDS in genome evolution due to the frequent presence of these sequences inserted in organellar genomes. Our phylogenetic analyses demonstrated similar evolutionary histories between the chloroplast and mitochondrial genomes. However, chloroplast phylogeny was better resolved with full support. Our taxonomical sampling supports the presence of three main lineages: Melanthalia/Curdiea, Gracilariopsis and Gracilaria. Melanthalia intermedia was sister to a monophyletic clade including Gracilaria and Gracilariopsis, which were resolved as monophyletic genera. Furthermore, the characteristics of organellar genome architecture, Gracilariopsis and Gracilaria genera are also supported by the loss of the plastid gene petP in Gracilaria and the rearrangement position of the gene trnH in the mitochondrial genome. Beside this, we found no support for the genus Hydropuntia as originally proposed / A família Gracilariaceae está globalmente distribuída e inclui várias espécies economicamente importantes. Atualmente, cinco gêneros são reconhecidos em Gracilariaceae: Gracilariophila (parasita), Curdiea, Melanthalia, Gracilaria e Gracilariopsis. Algumas espécies de Gracilaria foram taxonomicamente transferidas para Hydropuntia. Entretanto, esse gênero é bastante controverso. Técnicas de sequenciamento de alta performance (HTS) levaram a um aumento de estudos usando genomas organelares completos, que têm sido usados para inferir relações filogenéticas em Rhodophyta e na investigação de outros aspectos dos genomas de algas vermelhas, incluindo sintenia gênica e transferências horizontal de genes (HGT). O HTS também facilitou a busca por plasmídeos extracromossômicos e sua influência nos genomas organelares por HGT. Nós utilizamos HTS para montar e anotar genomas organelares (mitocôndrias e cloroplastos) de sete espécies de Gracilariaceae usando a plataforma Illumina HiSeq 2500 e recebemos sequências de 31 amostras Gracilariaceae da Dr. Goia Lyra que foram montadas, anotadas e incluídas em nossas análises. Utilizamos esses dados, combinados com genomas publicados, para inferir filogenias e comparar a arquitetura do genoma dessas espécies representando as principais linhagens em Gracilariaceae. Os genomas mitocondrial e plastidial são altamente conservados na sintenia gênica e a variação ocorreu principalmente em regiões onde foram encontradas inserções de sequências derivadas de plasmídeos (PDS), similares aos plasmídeos extracromossômicos conhecidos de algas vermelhas. Nos genomas mitocondriais, as inserções de PDS estavam em duas regiões onde a direção da transcrição muda: entre os genes cob e trnL e os genes trnA e trnN. As inserções de PDS no genoma do cloroplasto estavam em posições diferentes, mas geralmente encontradas entre os genes psdD e rrs. O operon bacteriano leu/leuD foi encontrado nos genomas dos cloroplastos de Gracilaria tenuistipitata, G. chilensis, M. intermedia e também no plasmídeo de G. vermiculophylla. As árvores filogenéticas mostram duas origens diferentes de leuC/leuD: os genes encontrados no cloroplasto e no plasmídeo estavam próximos de proteobactérias, e os genes codificados no núcleo estavam próximos de Viridiplantae e cianobactérias. Gracilariaceae pode ser um bom modelo para estudar o impacto de PDS na evolução de genomas devido à presença frequente de inserções PDS em genomas organelares. Nossas análises filogenéticas demonstraram histórias evolutivas similares entre cloroplasto e mitocondria. No entanto, a filogenia de cloroplasto foi melhor resolvida com valores máximos de Bootstrap em todos os ramos. Nossa amostragem taxonômica corrobora a presença de três linhagens principais: Melanthalia/Curdiea, Gracilariopsis e Gracilaria. Melanthalia intermedia aparece como grupo-irmão do clado monofilético incluindo Gracilaria e Gracilariopsis, que foram resolvidos como gêneros monofiléticos. Além disso, baseado nas características da arquitetura do genoma organelar, os gêneros Gracilariopsis e Gracilaria se distinguem pela perda do gene plastidial petP em Gracilaria e pela posição de rearranjo do gene trnH no genoma mitocondrial. Nós não encontramos evidências para a permanencia o gênero Hydropuntia como originalmente proposto

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Ana Flavia B Penido.pdf: 829056 bytes, checksum: 63d111404f5b1f9b2d136e54aad128a4 (MD5) Previous issue date: 2009-03-26 / Samonella spp are Gram negatives bactérias belonging to Enterobacteriaceae family. S. enterica comprise about 2.500 sorovars. These sorovars can infect a broad range, including poultry, cattle, swins and humans, and are agent causative of salmonellosis an important public health issue worldwide. Small multicopy plasmids are frequently isolated from Gram negatives and Gram positives bacterias. In Salmonella, low molecular weight plasmids are found on 10% of Salmonella strains and their biological functions are unknown. However, many plasmids in Salmonella control important properties, such as, virulence factors, heavy metals and antibiotics resistance, and utilizations of alternative carbon sources. The pVCM1 plasmid was extracted from one strain of Samonella enteretidis isolated from broilers carcass. The strains were grown in liquid or solid Luria-Bertani broth at 37 °C. The plasmid was purified, separated on 1% agarose electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining for analysis. Plasmid was digested with EcoRI enzyme and subcloned in the pUC18 vector.The plasmidal stability was evaluated, inoculating E. coli cells transformated with pVCM1 plasmid (cloned in pUC18) in liquid Luria-bertani broth supplemented with ampicillin. The pVCM1 was stable after 240 generations. The total DNA sequence of plasmid pVCM1 has 1981 pb. Genbank search resulted that pVCM1 showed 99% of identity with pB and 92% with pJ, which were isolated from Salmonella enteretidis. Only one ORF founded in pVCM1 showed significative similarity with others proteins of GenBank. The protein encoded by this ORF showed homology to Rep proteins of plasmids that replicates by rolling-circle mechanism. The pVCM1 posses three impotents elements: rep gene, single strand origin (SSO) and inverted repeat sequences. Such elements are importants for the rolling circle replication, suggesting that pVCM1 use this mechanism. The rep gene was amplified and cloned in the pGEMT-easy vector, but the heterologous expression of Rep protein wasn t gotten successfully. / Salmonellas ssp são bactérias Gram negativas pertencente a família das enterobácterias. A S. entérica compreende cerca de 2.500 sorovares. Esses sorovares podem infectar vários hospedeiros incluindo aves, bovinos, suínos e humanos, e são os agentes causais das salmoneloses, um importante problema de saúde pública em todo mundo. Múltiplas cópias de pequenos plasmídeos são frequentemente isolados de bactérias Gram negativas e Gram positivas. Nas salmonelas, plasmídeos com baixa massa molecular são encontradas em 10% das linhagens e suas funções biológicas são desconhecidas. Entretanto, muitos plasmídeos de salmonela controlam propriedades importantes, tais como, fatores de virulência, resistência a antibióticos e metais pesados, e utilização de fontes alternativas de carbono. O plasmídeo pVCM1 foi extraído de uma linhagem S. Enteritidis, isoladas de carcaças de frango. Essa linhagem foi crescida em meio Lúria-Bertani líquido e sólido à 37°C. O plasmídeo foi purificado, separado em gel de agarose 1% e visualizado com coloração por brometo de etídio. O plasmídeo foi digerido com EcoRI e subclonado no vetor pUC18. A estabilidade plasmidial foi avaliada inoculando células de E. coli transformadas com plasmídeo pVCM1 (clonado em pUC18) em meio Lúria- bertani líquido suplementado com ampicilina. O pVCM1 foi estável por mais de 240 gerações A sequência nucleotídica total do plasmídeo possui 1981 pb. Pequisa por sequências no GenBank, mostrou que o pVCM1 apresenta similaridade de 99% com o plasmídeo pB e 92% com plasmídeo pJ, os quais foram isolados de S. Enteritidis.Das 11 possíveis ORFS apenas uma única ORF apresentou similaridade significativa com outras proteínas do GenBank. A proteína codificada por essa ORF apresentou homologia com as proteínas Rep de plasmídeos que replicam via círculo rolante. O pVCM1 apresenta três regiões importantes: gene rep, origem de fita simples (SSO) e regiões repetidas invertidas. Tais regiões são importantes para o mecanismo de replicação via círculo rolante, sugerindo que o pVCM1 utilize esse mecanismo. O gene rep foi amplificado e clonado no vetor pGEM T-easy, mas a expressão heteróloga da proteína Rep não foi obtida com sucesso.

KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) são -lactamases da classe A de Ambler globalmente disseminadas, com 10 variantes, sendo predominates KPC-2 e KPC-3. O objetivo deste trabalho foi estudar a genética e epidemiologia molecular de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos isoladas no Brasil. Sessenta e quatro enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram analisadas: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) e 1 Citrobacter freundii (Cf), de diferentes pacientes, em seis hospitais e em duas distintas regiões do Brasil. Identificação e testes de sensibilidade antimicrobiana foram realizados por sistemas semi-automáticos e métodos padronizados. A relação clonal foi estabelecido por Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e também por tipagem por sequenciamento de multilocus no caso de K. pneumoniae. A presença de genes que codificam carbapenemases e -lactamases de espectro estendido foi pesquisada. A caracterização de blaKPC-2, do ambiente genético e de plasmídeos incluiu PCR e sequenciamento, análises de RFLP, S1-PFGE e hibridação. Os isolados Kp corresponderam a 5 pulsotipos, por PFGE, ligados a 6 tipos de sequência (ST): KPA-ST258 (n = 51 com 6 subtipos), KpA6-ST11 (n = 1), KPB-ST327 (n = 1), KPC-ST44 (n = 2), KPD-ST437 (n = 1) e KPE-ST48 (n = 1). Ecl foram agrupados em clones e e, Sm e Cf representam um clone cada. Todos os isolados foram resistentes aos -lactâmicos, sensíveis à colistina e tigeciclina e mostraram fenótipos variáveis contra aminoglicosídeos, quinolonas, nitrofurantoína e sulfametoxazol-trimetoprim. Heterorresistência a carbapenêmicos foi observada para isolados de Kp e Cf, conforme relatado anteriormente com produtores de KPC-2 e VIM. Esse estudo relata a disseminação do gene blaKPC-2 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro facilitada por clones de K. pneumoniae pertencentes ao globalmente disseminado Complexo Clonal CC258 (ST258, ST437 e ST11) e uma diversidade de plasmídeos (IncFII-KpA, IncN-Kp e Ecl, IncL/M-Sm e Cf e, dois plasmídeos não-tipáveis carreando Tn4401a ou Tn4401b) disseminados com sucesso entre as enterobactérias. Constitui também a primeira descrição do ST258 no Brasil associada a um surto em um hospital universitário da cidade de Ribeirao Preto. Este trabalho apontou a alta diversidade de elementos genéticos disponíveis abrigando blaKPC-2. Isso poderia ampliar enormemente a disseminação desse gene no Brasil como também no continente. / KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) are globally spread -lactamases of the Ambler class A comprising 10 variants, KPC-2 and KPC-3 being predominant. The objective of this work was study the genetic and molecular epidemiology of carbapenem resistant-enterobacterial isolates in Brazil. Sixty-four carbapenem resistant isolates were analyzed: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) and 1 Citrobacter freundii (Cf) from different patients at six hospitals in two different Brazilian regions. Identification and antimicrobial susceptibility testing were accomplished by using semiautomatic systems and standard methods. Clonal relatedness was established by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) and also by multilocus sequence typing in the case K. pneumoniae isolates. The presence of genes encoding carbapenemases and extended spectrum -lactamases was searched. Characterization of blaKPC-2, genetic environment and plasmids included PCR and further sequencing, RFLP analyses, S1-PFGE and hybridization. The Kp isolates corresponded to 5 PFGE types linked to 6 sequence types (ST): KpA-ST258 (n=51 comprising 6 subtypes), KpA6-ST11 (n=1), KpB-ST327 (n=1), KpC-ST44 (n=2), KpD-ST437 (n=1) and KpE-ST48 (n=1). Ecl isolates were grouped in and clones and, Sm and Cf represent one clone each. All isolates were resistant to -lactams, susceptible to colistin and tigecycline and showed variable phenotype against aminoglycosides, quinolones, nitrofurantoin and trimethoprim-sulfamethoxazole. Heteroresistance to carbapenems was observed for Kp and Cf isolates, as previously reported to KPC-2 and VIM producers. This study reports the spread of blaKPC-2 in Sao Paulo and Rio de Janeiro states facilitated by globally spread CC258-K. pneumoniae clones (ST258, ST11, ST437) and a diversity of plasmids (IncFII-KpA, IncN-Kp and Ecl, IncL/M-Sm and Cf and, two untypeable plasmids carrying Tn4401a or Tn4401b) successfully disseminated among Enterobacteriaceae species. It also constitutes the first description of ST258 in Brazil which was associated with a hospital outbreak in Ribeirao Preto city. This work pointed out the high diversity of available genetic elements harboring blaKPC-2. This might greatly amplify the dissemination of KPC genetic in Brazil and within of the South America continent.