COSTA. Luís Eduardo Castanheira. Fração polissacarídica extraída da alga vermelha Gracilaria intermedia: atividade anti-inflamatória e antinociceptiva. 2014. 78 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-23T21:25:02Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_leccosta.pdf: 1330705 bytes, checksum: ae09e8991cebe3eada65ac66e53c41a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-25T22:03:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_leccosta.pdf: 1330705 bytes, checksum: ae09e8991cebe3eada65ac66e53c41a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-25T22:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_leccosta.pdf: 1330705 bytes, checksum: ae09e8991cebe3eada65ac66e53c41a5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Seaweeds from the Gracilaria genus are an important source of agar and sulfated polysaccharides and are commonly used in food, pharmaceutical and biotechnology industries. The objective of this study was to extract, structurally characterize and evaluate the anti-inflammatory and antinociceptive effects of a sulfated plysaccharide extracted from the red alga Gracilaria intermedia. A sulfated polysaccharide fraction was extracted from the red alga Gracilaria intermedia by enzymatic digestion with papain. The sugar content and protein contamination were evaluated through colorimetric tests. The material presented high yield and purity, without any protein contamination. The sulfated polysaccharides extracted were subjected to structural characterization analysis by Fourier transform infrared spectroscopy and the average molecular weight of the polysaccharide fraction was determined by Gel Permeation Chromatography (GPC). The polysaccharide fraction was identified as an agaran with a molecular weight of 410 kDa. Anti-inflammatory activity tests were conducted in models of paw edema induced by carrageenan, dextran, compound 48/80, serotonin, and histamine. The anti-inflammatory effect of the polysaccharide on carrageenan-induced peritonitis was also evaluated, with subsequent counting of leukocytes and neutrophils, as well as measurement of TNF-α and interleukin-1β levels. The results of the anti-inflammatory activity tests indicate that the extracted polysaccharide exhibits high anti-inflammatory activity and this activity is related to inhibition of inflammatory mediators. The antinociceptive activity was evaluated using models of writhing induced by acetic acid, formalin test and hot plate. The antinociceptive tests showed that the extracted polysaccharide had analgesic activity in the writhing test induced by acetic acid and in the formalin test but showed no significant reduction in the hot plate test, suggesting an action mechanism in the peripheral system. The sulfated polysaccharides derived from seaweed Gracilaria intermedia show potential for future use as an anti-inflammatory compound. / As algas marinhas do gênero Gracilaria são importantes fontes de ágar e polissacarídeos sulfatados e são comumente utilizadas nas indústrias alimentícia, farmacêutica e biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi extrair, caracterizar estruturalmente e avaliar o potencial anti-inflamatório e antinociceptivo de uma fração polissacarídica extraida da alga Gracilaria intermedia. Uma fração de polissacarídeos sulfatados foi obtida a partir da alga vermelha Gracilaria intermedia através de extração enzimática com papaína. O teor de açucar e contaminação por proteínas foram avaliados através de testes colorimétricos. O material apresentou alto rendimento após a extração e alta pureza, sem contaminação por proteínas. Os polissacarídeos foram submetidos a testes de caracterização estrutural através da análise por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e a massa molar média da fração polissacarídica foi determinada através de Cromatografia por Permeação em Gel (GPC). O polissacarídeo foi identificado como uma agarana, com um peso molecular de 410 kDa. Foram realizados testes de atividade anti-inflamatória em modelos de edema de pata induzido por carragenana, dextrana, composto 48/80, serotonina e histamina. Também foi avaliado o efeito anti-inflamatório do polissacarídeo em modelo de peritonite induzida por carragenana, com posterior contagem de leucócitos e neutrófilos, assim como medição dos níveis de TNF-α e interleucina-1β. Os resultados indicam que o polissacarídeo extraído apresenta alta atividade anti-inflamatória e esta atividade está relacionada à inibição de mediadores inflamatórios. A atividade antinociceptiva foi avaliada através de modelos de contorção abdominal induzida por acido acético, teste da formalina e placa quente. Os demonstraram que o polissacarídeo extraído apresentou atividade analgésica nos testes de contorção abdominal induzida por ácido acético e no teste da formalina mas não apresentou redução significativa no teste de placa quente, sugerindo um mecanismo de ação a nível de sistema periférico. Os polissacarídeos sulfatados obtidos a partir da alga marinha Gracilaria intermedia mostram potencial para serem utilizados futuramente como princípio ativo para um composto anti-inflamatório.

Gracilariaceae is a worldwide distributed family that includes numerous economically important species. Currently, five genera are recognized in the Gracilariaceae: Gracilariophila (parasitic), Curdiea, Melanthalia, Gracilaria, and Gracilariopsis. Some species of Gracilaria were taxonomically transferred to Hydropuntia. However, this genus is quite controversial. High-throughput sequencing (HTS) techniques has led to an increase in studies using complete organellar genomes, which have been used to infer phylogenetic relationships in Rhodophyta and the investigation of other aspects of red algal genomes, including gene synteny and horizontal gene transfers (HGT). HTS also facilitated the search for extrachromosomal plasmids and its influence in the organellar genomes by HGT. We applied HTS to assemble and annotate organellar genomes (mitochondria and chloroplast) from seven species of Gracilariaceae using Illumina HiSeq 2500 platform. We also received raw reads of 31 samples of Gracilariaceae from Dr. Goia Lyra that were analysed and included in our work. We used these data, combined with published genomes, to infer phylogenies and compare the genome architecture of these species representing the main lineages in Gracilariaceae. The mitochondrial and chloroplast genomes were highly conserved in gene synteny among the species, and variation mainly occurred in regions where insertions of plasmid-derived sequences (PDSs) were found, which were similar to known red algae extrachromosomal plasmids. In mitochondrial genomes, the PDS insertions were in two regions where the transcription direction changes: between cob and trnL genes, and trnA and trnN genes. PDS insertions in chloroplast genome were in different positions, but generally found between psdD and rrs genes. The bacterial leuC/leuD operon was found in Gracilaria tenuistipitata, G. chilensis, M. intermedia chloroplasts genomes, and also in G. vermiculophylla extrachromosomal plasmid. Phylogenetic trees show two different origins of leuC/leuD: genes found in chloroplasts and plasmids were close to proteobacteria, and genes encoded in the nucleus are close to Viridiplantae and cyanobacteria. Gracilariaceae may be a good model to study the impact of PDS in genome evolution due to the frequent presence of these sequences inserted in organellar genomes. Our phylogenetic analyses demonstrated similar evolutionary histories between the chloroplast and mitochondrial genomes. However, chloroplast phylogeny was better resolved with full support. Our taxonomical sampling supports the presence of three main lineages: Melanthalia/Curdiea, Gracilariopsis and Gracilaria. Melanthalia intermedia was sister to a monophyletic clade including Gracilaria and Gracilariopsis, which were resolved as monophyletic genera. Furthermore, the characteristics of organellar genome architecture, Gracilariopsis and Gracilaria genera are also supported by the loss of the plastid gene petP in Gracilaria and the rearrangement position of the gene trnH in the mitochondrial genome. Beside this, we found no support for the genus Hydropuntia as originally proposed / A família Gracilariaceae está globalmente distribuída e inclui várias espécies economicamente importantes. Atualmente, cinco gêneros são reconhecidos em Gracilariaceae: Gracilariophila (parasita), Curdiea, Melanthalia, Gracilaria e Gracilariopsis. Algumas espécies de Gracilaria foram taxonomicamente transferidas para Hydropuntia. Entretanto, esse gênero é bastante controverso. Técnicas de sequenciamento de alta performance (HTS) levaram a um aumento de estudos usando genomas organelares completos, que têm sido usados para inferir relações filogenéticas em Rhodophyta e na investigação de outros aspectos dos genomas de algas vermelhas, incluindo sintenia gênica e transferências horizontal de genes (HGT). O HTS também facilitou a busca por plasmídeos extracromossômicos e sua influência nos genomas organelares por HGT. Nós utilizamos HTS para montar e anotar genomas organelares (mitocôndrias e cloroplastos) de sete espécies de Gracilariaceae usando a plataforma Illumina HiSeq 2500 e recebemos sequências de 31 amostras Gracilariaceae da Dr. Goia Lyra que foram montadas, anotadas e incluídas em nossas análises. Utilizamos esses dados, combinados com genomas publicados, para inferir filogenias e comparar a arquitetura do genoma dessas espécies representando as principais linhagens em Gracilariaceae. Os genomas mitocondrial e plastidial são altamente conservados na sintenia gênica e a variação ocorreu principalmente em regiões onde foram encontradas inserções de sequências derivadas de plasmídeos (PDS), similares aos plasmídeos extracromossômicos conhecidos de algas vermelhas. Nos genomas mitocondriais, as inserções de PDS estavam em duas regiões onde a direção da transcrição muda: entre os genes cob e trnL e os genes trnA e trnN. As inserções de PDS no genoma do cloroplasto estavam em posições diferentes, mas geralmente encontradas entre os genes psdD e rrs. O operon bacteriano leu/leuD foi encontrado nos genomas dos cloroplastos de Gracilaria tenuistipitata, G. chilensis, M. intermedia e também no plasmídeo de G. vermiculophylla. As árvores filogenéticas mostram duas origens diferentes de leuC/leuD: os genes encontrados no cloroplasto e no plasmídeo estavam próximos de proteobactérias, e os genes codificados no núcleo estavam próximos de Viridiplantae e cianobactérias. Gracilariaceae pode ser um bom modelo para estudar o impacto de PDS na evolução de genomas devido à presença frequente de inserções PDS em genomas organelares. Nossas análises filogenéticas demonstraram histórias evolutivas similares entre cloroplasto e mitocondria. No entanto, a filogenia de cloroplasto foi melhor resolvida com valores máximos de Bootstrap em todos os ramos. Nossa amostragem taxonômica corrobora a presença de três linhagens principais: Melanthalia/Curdiea, Gracilariopsis e Gracilaria. Melanthalia intermedia aparece como grupo-irmão do clado monofilético incluindo Gracilaria e Gracilariopsis, que foram resolvidos como gêneros monofiléticos. Além disso, baseado nas características da arquitetura do genoma organelar, os gêneros Gracilariopsis e Gracilaria se distinguem pela perda do gene plastidial petP em Gracilaria e pela posição de rearranjo do gene trnH no genoma mitocondrial. Nós não encontramos evidências para a permanencia o gênero Hydropuntia como originalmente proposto

Mitocôndrias são organelas semi-autônomas responsáveis pela respiração celular. Diversas fontes de evidências indicam a origem endossimbiótica dessas organelas, onde um organismo unicelular teria engolfado um organismo procariótico, possivelmente uma α-proteobactéria. Durante a coevolução do endossimbionte e sua célula hospedeira, ocorreu uma redução do genoma do endossimbionte, parte dos genes sendo perdida e parte transferida para o núcleo. A organização e o tamanho do genoma mitocondrial é bastante variável nas diferentes linhagens filogenéticas. O acúmulo de dados moleculares ajuda a esclarecer a origem e evolução das mitocôndrias. Até o momento, foram sequenciados os genomas mitocondriais de apenas três espécies de Rhodophyta, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae e Porphyra purpurea. As algas vermelhas são economicamente importantes por serem utilizadas principalmente como alimento e para as extrações de polissacarídeos e pigmentos acessórios. Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia é uma macroalga vermelha que apresenta grande tolerância a fatores ambientais e alta taxa de crescimento, sendo utilizada como organismo modelo em estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares, incluindo o sequenciamento do genoma completo do cloroplasto feito anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa. Este estudo teve como objetivo o sequenciamento completo do genoma mitocondrial de G. tenuistipitata, a análise dos genes presentes e a comparação entre os genomas mitocondriais de Rhodophyta e de outros organismos fotossintetizantes disponíveis no GenBank. Para isso, foram realizadas extrações de DNA total para as amplificações por PCR, para posterior sequenciamento por primer walking e montagem do genoma mitocondrial completo de G. tenuistipitata. A sequência completa do genoma mitocondrial circular da alga vermelha G. tenuistipitata possui 25.565 nucleotídeos e conteúdo CG de 27%. Foram identificados 50 genes, que incluem sete subunidades do complexo NADH desidrogenase (nad 1-6, nad 4L), três do complexo sucinato desidrogenase (sdh 2-4), o gene apocitocromo b (cob), três subunidades da citocromo c oxidase (cox 1-3), três do complexo ATP sintase (atp 6,atp 8-9), cinco genes para proteínas ribossômicas (rps 3, rps 11-12, rpl 16, rpl 20), três genes para RNA ribossômico (rrn 5, rnl, rns) e 22 para RNA transportador. Um intron do grupo II está inserido no tRNA para histidina. Os genes mitocondriais de G. tenuistipitata estão organizados em dois conjuntos codificados um em cada fita do DNA, em direções de transcrição opostas. O genoma mitocondrial de Gracilaria tenuistipitata é bastante compacto, com poucas regiões intergênicas e utiliza um código genético modificado. O conteúdo de genes e sua ordem no genoma mitocondrial de G. tenuistipitata são extremamente semelhantes ao de C. crispus e os genomas mitocondriais de ambas apresentam identidade de nucleotídeos superior a 70% em todas as análises realizadas. Essa semelhança pode ser explicada pelo fato de ambas as algas pertencerem à mesma classe, Florideophyceae. As quatro espécies de Rhodophyta comparadas neste trabalho possuem os componentes básicos da cadeia respiratória e síntese de ATP, além de algumas proteínas ribossômicas e de um conjunto quase completo de tRNAs e rRNAs. Este trabalho corrobora estudos filogenéticos anteriores em relação às algas vermelhas, evidenciando que G. tenuistipitatae C. crispus são mais próximos entre si e igualmente distantes de P. purpurea, e que C. merolae se encontra em uma posição mais basal. / Mitochondria are semi-autonomous organelles responsible for cellular respiration. Many sources of evidence indicate the endosymbiotic origin of these organelles, in which an unicellular organism engulfed a prokaryotic organism, possibly an α-proteobacteria. During the endosymbiont and its host coevolution, the endosymbiont genome was reduced by gene loss and gene transfer to the nucleous. The mitochondrial genome size and organization varies within different phylogenetic lineages. The accumulation of molecular data helps to elucidate the origin and evolution of mitochondria. So far, only three species of Rhodophyta had their mitochondrial genome totally sequenced, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae and Porphyra purpurea. Red algae are economically important due to their use as food and for the extraction of polysacarids and accessory pigments. Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia is a red macroalgae very tolerant to environmental changes and shows high growth rates, being used as model organism in physiological, biochemical and molecular studies, including the sequencing of the whole chloroplast genome done by our research group. This study aimed the sequencing of the whole mitochondrial genome of G. tenuistipitata, the analysis of its gene content and the comparison within mitochondrial genomes of Rhodophyta and other photosynthetic organisms available at the GenBank. For that, total DNA was extracted for PCR amplifications, which were sequenced using primer walking and assembled to obtain the complete mitochondrial genome of G. tenuistipitata. The whole mitochondrial circular genome sequence of the red algae G. tenuistipitata was determined (25.565 nucleotides, C+G content 27%). Fifty genes were identified, including seven NAD H dehydrogenase complex subunits (nad 1-6, nad 4L), three succinate dehydrogenase complex subunits (sdh2-4), the apocytochrome b gene cob), three cytochrome c oxidase subunits (cox1-3), three ATP synthase complex subunits (atp6, atp8-9), five ribosomal proteins (rps3, rps11-12, rpl16, rpl20), three ribosomal RNA genes (rrn5, rnl, rns) and 22 tRNAs. One group II introns was found between the tRNA sup His /SUP. The mitochondrial genes of G. tenuistipitata are organized in two groups translated each one in each strand, in two opposite directions. The mitochondrial 13 genome of Gracilaria tenuistipitata is quite compact, with few intergenic regions and uses a modified genetic code. The gene content and its order in the mitochondrial genome of G. tenuistipitata are extremely similar to the C. crispus mitochondrial genome, and both genomes presented nucleotide identity above 70% in all the analyses. This similarity between the mtDNA of both species can be explained by the fact that both belong to the same class, Florideophyceae. The four Rhodophyta species compared in this study have the essencial components for the respiratory chain and ATP synthesis, besides some ribosomal proteins and almost all of the tRNAs and rRNAs. This work corroborate previous phylogenetic studies about red algae, showing that G. tenuistipitata and C. crispus are more closely related between each other than to P. purpurea, and that C. merolae is in a basal position.

Mitocôndrias são organelas semi-autônomas responsáveis pela respiração celular. Diversas fontes de evidências indicam a origem endossimbiótica dessas organelas, onde um organismo unicelular teria engolfado um organismo procariótico, possivelmente uma α-proteobactéria. Durante a coevolução do endossimbionte e sua célula hospedeira, ocorreu uma redução do genoma do endossimbionte, parte dos genes sendo perdida e parte transferida para o núcleo. A organização e o tamanho do genoma mitocondrial é bastante variável nas diferentes linhagens filogenéticas. O acúmulo de dados moleculares ajuda a esclarecer a origem e evolução das mitocôndrias. Até o momento, foram sequenciados os genomas mitocondriais de apenas três espécies de Rhodophyta, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae e Porphyra purpurea. As algas vermelhas são economicamente importantes por serem utilizadas principalmente como alimento e para as extrações de polissacarídeos e pigmentos acessórios. Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia é uma macroalga vermelha que apresenta grande tolerância a fatores ambientais e alta taxa de crescimento, sendo utilizada como organismo modelo em estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares, incluindo o sequenciamento do genoma completo do cloroplasto feito anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa. Este estudo teve como objetivo o sequenciamento completo do genoma mitocondrial de G. tenuistipitata, a análise dos genes presentes e a comparação entre os genomas mitocondriais de Rhodophyta e de outros organismos fotossintetizantes disponíveis no GenBank. Para isso, foram realizadas extrações de DNA total para as amplificações por PCR, para posterior sequenciamento por primer walking e montagem do genoma mitocondrial completo de G. tenuistipitata. A sequência completa do genoma mitocondrial circular da alga vermelha G. tenuistipitata possui 25.565 nucleotídeos e conteúdo CG de 27%. Foram identificados 50 genes, que incluem sete subunidades do complexo NADH desidrogenase (nad 1-6, nad 4L), três do complexo sucinato desidrogenase (sdh 2-4), o gene apocitocromo b (cob), três subunidades da citocromo c oxidase (cox 1-3), três do complexo ATP sintase (atp 6,atp 8-9), cinco genes para proteínas ribossômicas (rps 3, rps 11-12, rpl 16, rpl 20), três genes para RNA ribossômico (rrn 5, rnl, rns) e 22 para RNA transportador. Um intron do grupo II está inserido no tRNA para histidina. Os genes mitocondriais de G. tenuistipitata estão organizados em dois conjuntos codificados um em cada fita do DNA, em direções de transcrição opostas. O genoma mitocondrial de Gracilaria tenuistipitata é bastante compacto, com poucas regiões intergênicas e utiliza um código genético modificado. O conteúdo de genes e sua ordem no genoma mitocondrial de G. tenuistipitata são extremamente semelhantes ao de C. crispus e os genomas mitocondriais de ambas apresentam identidade de nucleotídeos superior a 70% em todas as análises realizadas. Essa semelhança pode ser explicada pelo fato de ambas as algas pertencerem à mesma classe, Florideophyceae. As quatro espécies de Rhodophyta comparadas neste trabalho possuem os componentes básicos da cadeia respiratória e síntese de ATP, além de algumas proteínas ribossômicas e de um conjunto quase completo de tRNAs e rRNAs. Este trabalho corrobora estudos filogenéticos anteriores em relação às algas vermelhas, evidenciando que G. tenuistipitatae C. crispus são mais próximos entre si e igualmente distantes de P. purpurea, e que C. merolae se encontra em uma posição mais basal. / Mitochondria are semi-autonomous organelles responsible for cellular respiration. Many sources of evidence indicate the endosymbiotic origin of these organelles, in which an unicellular organism engulfed a prokaryotic organism, possibly an α-proteobacteria. During the endosymbiont and its host coevolution, the endosymbiont genome was reduced by gene loss and gene transfer to the nucleous. The mitochondrial genome size and organization varies within different phylogenetic lineages. The accumulation of molecular data helps to elucidate the origin and evolution of mitochondria. So far, only three species of Rhodophyta had their mitochondrial genome totally sequenced, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae and Porphyra purpurea. Red algae are economically important due to their use as food and for the extraction of polysacarids and accessory pigments. Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia is a red macroalgae very tolerant to environmental changes and shows high growth rates, being used as model organism in physiological, biochemical and molecular studies, including the sequencing of the whole chloroplast genome done by our research group. This study aimed the sequencing of the whole mitochondrial genome of G. tenuistipitata, the analysis of its gene content and the comparison within mitochondrial genomes of Rhodophyta and other photosynthetic organisms available at the GenBank. For that, total DNA was extracted for PCR amplifications, which were sequenced using primer walking and assembled to obtain the complete mitochondrial genome of G. tenuistipitata. The whole mitochondrial circular genome sequence of the red algae G. tenuistipitata was determined (25.565 nucleotides, C+G content 27%). Fifty genes were identified, including seven NAD H dehydrogenase complex subunits (nad 1-6, nad 4L), three succinate dehydrogenase complex subunits (sdh2-4), the apocytochrome b gene cob), three cytochrome c oxidase subunits (cox1-3), three ATP synthase complex subunits (atp6, atp8-9), five ribosomal proteins (rps3, rps11-12, rpl16, rpl20), three ribosomal RNA genes (rrn5, rnl, rns) and 22 tRNAs. One group II introns was found between the tRNA sup His /SUP. The mitochondrial genes of G. tenuistipitata are organized in two groups translated each one in each strand, in two opposite directions. The mitochondrial 13 genome of Gracilaria tenuistipitata is quite compact, with few intergenic regions and uses a modified genetic code. The gene content and its order in the mitochondrial genome of G. tenuistipitata are extremely similar to the C. crispus mitochondrial genome, and both genomes presented nucleotide identity above 70% in all the analyses. This similarity between the mtDNA of both species can be explained by the fact that both belong to the same class, Florideophyceae. The four Rhodophyta species compared in this study have the essencial components for the respiratory chain and ATP synthesis, besides some ribosomal proteins and almost all of the tRNAs and rRNAs. This work corroborate previous phylogenetic studies about red algae, showing that G. tenuistipitata and C. crispus are more closely related between each other than to P. purpurea, and that C. merolae is in a basal position.