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000820049.pdf: 2105902 bytes, checksum: 4babbf05a831bb8f239b3365414bc5f7 (MD5) / O sistema ParE-ParD, identificado no plasmídeo RK2 de uma ampla gama de hospedeiros, é um sistema toxina-antitoxina (TA), sendo ParE (103 aminoácidos) a toxina e ParD (83 aminoácidos) a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE pela formação de um complexo estável, que também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. ParE possui atividade citotóxica na replicação do DNA por interferir no mecanismo de ação da DNA girase. Diversos estudos demonstraram que ParD consiste de duas regiões estruturalmente distintas: uma N-terminal, bem ordenada que consiste no sitio de ligação do DNA e outra C-terminal, não estruturada, onde sugere-se ocorrer a ligação da toxina. Em relação à ligação com a toxina, um modelo atual de reconhecimento e ligação em sistemas TA invoca uma transição de fases desordenada-ordenada, na parte C-terminal da antitoxina, porém faltam dados que confirmem se este modelo de transição de fases desordenada-ordenada também pode ser aplicado para o sistema ParE-ParD. Neste sentido, este trabalho objetivou o design, a síntese e o estudo de interação de peptídeos derivados da toxina ParE, com peptídeos derivados da antitoxina ParD. Com base nas informações estruturais destas proteínas, sequências peptídicas derivadas de ParE e ParD foram projetadas, com o propósito de encontrar a estrutura mínima de ParD capaz de neutralizar a ação tóxica de ParE. As sequências peptídicas foram sintetizadas pela metodologia de fase sólida, purificadas e analisadas por HPLC e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação dos peptídeos foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. A fluorescência intrínseca dos peptídeos denominados ParEAC2 e ParEAC3 foi suprimida pelos derivados de ParD, evidenciando a formação de complexos estáveis entre as espécies, resultados... / The ParE-ParD system represents a toxin-antitoxin module of the broad host range plasmid RK2. ParE (103 amino acids) is the toxin, whereas ParD (83 amino acids) constitutes the antidote able to neutralize ParE by forming a stable complex that is also effective in the autorepression of the parDE operon. The ParE toxin inhibits DNA gyrase activity and thereby blocks DNA replication. Several studies have shown that ParD consists of two structurally distinct regions: an N-terminal, orderly, consisting of the DNA binding site and another C-terminus, unstructured, where it is suggested to occur toxin binding. For binding with toxin, a current model of recognition and binding in TA systems invokes a disorder-to-order transition in the antitoxin. Specifically, a disordered region of the free antitoxin is organized into a well-defined secondary structure upon binding to its cognate toxin. But, no available data that proves the application of disorder-to-order transition model for ParE-ParD system. Therefore, this work aims to study the interaction of the ParE protein and its analogues with peptides from ParD antitoxin. Based on the structural information's of these proteins, peptide sequences derived from ParE and ParD were designed in order to find the minimal ParD structure able to neutralize the toxic effect of ParE. The peptide sequences were synthesized by solid phase methodology, purified and analyzed by HPLC and characterized by mass spectrometry. The interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence quenching assays. The intrinsic fluorescence of the denominated ParEAC2 and ParEAC3 peptides was quenched by ParD derivatives, evidencing complex formation, results confirmed by affinity chromatography assays. Molecular Docking studies demonstrated that the interaction mode of ParEAC3-ParDAC3 complex was consistent with the obtained crystallographic complex ParE-ParD of...
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unesp.br:11449/126357 |
| Date | 15 December 2014 |
| Creators | Caires, Ana Carla [UNESP] |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista (UNESP), Marchetto, Reinaldo [UNESP] |
| Publisher | Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 112 f. : il. - |
| Source | Aleph, reponame:Repositório Institucional da UNESP, instname:Universidade Estadual Paulista, instacron:UNESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -1, -1 |
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