Bacillus thuringiensis var. israelensis é uma bactéria entomopatogênica capaz de sintetizar um cristal protéico composto por endotoxinas. Estas endotoxinas são utilizadas em formulações de biolarvicidas, sendo efetivas contra dípteros que representam um problema para a saúde humana. Neste trabalho, estudou-se a influência de fontes protéicas, de substratos energéticos, da temperatura e do pH sobre o crescimento celular, a esporulação e a expressão de endotoxinas de B. thuringiensis var. israelensis, em frascos agitados e em fermentador de bancada. Foram estudadas fontes protéicas de menor custo em substituição ao extrato de levedura de laboratório. Melhores resultados, com relação ao crescimento celular, à esporulação e à mortalidade de larvas de Culex quinquefasciatus, foram obtidos com 12 g/L de extrato de levedura bruto Prodex (ELB) ou 20 g/L de farelo de soja (FS) em biorreator de bancada, com valores máximos de demanda de oxigênio pelo cultivo (OUR) de 58,1 e 53,3 mmolO2/L/h, máxima concentração celular (X) de 12 g/L, esporulação de 3.1012 e 6.1012 esporos/mL e concentração letal mediana (CL50) de 0,21 e 0,45 ppm, respectivamente. Entre estas alternativas, o ELB, com um custo muito inferior ao do extrato de levedura de laboratório, foi considerado como uma fonte de proteína mais adequada que o farelo de soja por ser completamente solúvel o que representaria uma vantagem em processos em larga escala. Com relação aos substratos energéticos estudados (glicose, sacarose e lactose), a glicose, nas concentrações de 10 e 20 g/L, apresentou os resultados mais expressivos em termos de respiração (OUR máximo apoximadamente 60 mmolO2/L/h, em ambos os cultivos), de crescimento (X máxima = 8,2 e 12 g/L, respectivamente) e esporulação (1012 esporos/mL em 26 e 28 horas, respectivamente). A expressão de endotoxinas foi maior em meios com glicose ou sacarose, observando-se em eletroforese as bandas de 26, 70 e 128 kDa. Apesar do crescimento celular inferior, a sacarose (10 g/L), um carboidrato de custo relativamente baixo no Brasil, pode ser utilizada como substrato para Bti uma vez que permite a expressão das endotoxinas em estudo. A temperatura mostrou grande influência sobre o cultivo de Bti, sendo 27 e 30oC as que proporcionaram as mais altas OUR (88,1 e 66,1 mmolO2/L/h), X (13 g/L, em ambos os cultivos) e esporulação (8 e 7.1010 esporos/mL), assim como maior expressão das endotoxinas de 70 e 26 kDa em meios com ELB (12 g/L) e glicose ( 20 g/L). Entre as duas, a temperatura de 27oC, porém, foi considerada mais adequada por facilitar a transferência de oxigênio em cultivo de Bti. Os baixos valores de pH, observados quando o cultivo foi realizado sem controle e quando foi controlado em 5,5, influenciaram negativamente a produção de biomassa que atingiu 9,5 g/L. Com o pH controlado em 6,2 e 7,0 ou quando variou entre 7,0 e 5,5, o maior valor de X foi de cerca de 12 g/L. Apesar disso, a contagem de esporos foi semelhante em todos os ensaios: aproximadamente 1012 esporos/mL, em cerca de 30 horas de cultivo. Uma melhor expressão das endotoxinas de 26, 70 e 128 kDa foi evidenciada quando o pH foi mantido próximo da neutralidade. / The entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis produces a crystal protein formed by endotoxins. These endotoxins are used in the formulation of biolarvicides effective for the control of diptera, which represent a problem for human health. In this work, the influence of nitrogen sources, energetic substrates, temperature, and pH on the cell growth, spore formation, and the expression of endotoxins by B. thuringiensis var. israelensis was studied in shake-flask and bioreactor experiments. Low-cost nitrogen sources were studied for the substitution of laboratory yeast extract. The best results for cell growth, spore formation and lethality of Culex quinquefasciatus larvae were obtained in bench bioreactor with medium containing 12 g/L of the bulk yeast extract Prodex (BYE) or 20 g/L of soy bran (SB), with maximum oxygen uptake rate values (OUR) of 58.1 and 53.3 mmolO2/L/h, maximum cell concentration of 12 g/L, spore counting of 3.1012 and 6.1012 spores/mL, and medium lethal concentration (LC50) of 0.21 and 0.45 ppm, respectively. In this comparison, BYE, which is much cheaper than laboratory yeast extract, was preferred as a protein source than soy bran because it is completely soluble, which could be an advantage in large-scale processing. With respect to the energetic substrates evaluated (glucose, sucrose and lactose), glucose, in concentrations of 10 and 20 g/L, led to the most significant results for respiration (maximum OUR approximately 60 mmolO2/L/h for both conditions), cell growth (maximum X = 8.2 and 12 g/L, respectively), and spore counting (1012 spores/mL in 26 and 28 hours, approximately). In media containing glucose or sucrose, the presence of toxins of 26, 70, and 128 kDa was observed. Despite the inferior cell growth observed, sucrose (10 g/L), a relatively low-cost carbohydrate in Brazil, could be used as a substrate for Bti cultivation since the endotoxins studied were expressed. With lactose, no significant result was found. The temperature of the medium exerts a major influence on the cultivation of Bti. At 27 and 30ºC, the higher values for the maximum OUR (88.1 and 66.1 mmolO2/L/h), X (13 g/L for both conditions) and spore counting (8 and 7.1010 spores/mL) were measured. The more intense expression for proteins of 70 and 26 kDa, in mediu containing BYE (12 g/L) and glucose (20 g/L), were also observed at these temperatures. The temperature of 27ºC can be considered as a better temperature for this process since oxygen supply would be facilitated at this condition. The low pH observed when the cultivation was performed without pH control or with pH kept constant at 5.5 led to decreasing values of biomass concentration which reached 9.5 g/L. When the pH was controlled in 6.2 and 7.0 or varied from 7.0 to 5.5, the maximum X was measured as 12 g/L. Despite such a difference, spore counting was similar in all experiments: 1012 spores/mL in approximately 30 hours of cultivation. A better expression of endotoxins of 26, 70, and 128 kDa was detected when the pH was kept close to neutral values.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ucs.br:11338/169 |
| Date | 20 October 2006 |
| Creators | Panarotto, Cíntia |
| Contributors | Silveira, Maurício Moura da |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UCS, instname:Universidade de Caxias do Sul, instacron:UCS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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