Cette thèse porte sur la sélection d’anticorps humains et la découverte de nouveaux biomarqueurs en vue d’un diagnostic et d’une thérapie de l’athérosclérose. Le premier volet concerne, dans un premier temps, la sélection d’anticorps humains dans un contexte physiopathologique chez un modèle animal de l’athérosclérose. La sélection in vivo a permis de sélectionner des anticorps sur large pannel de cibles dans leur conformation native et sous l’influence de leur microenvironnement. Suite à cela, afin d’accéder à la spécificité des clones, une méthode innovante de criblage a été développée, la cytométrie de flux à moyen débit. Cette technique, contrairement à l’ELISA couramment utilisé pour la caractérisation d’anticorps ou de peptides, ne nécessite pas de connaitre l’antigène et permet également de travailler à des concentrations de protéines moindres. Ainsi, deux cents anticorps ont pu être sélectionnés. Les tests d’affinité et de caractérisation de ces anticorps ont, par la suite, mené à l’identification d’une nouvelle cible de la plaque d’athérome, la galectine 3, protéine impliquée dans l’activation des macrophages ainsi que la rétention des LDL oxydées par ces dernières. Le deuxième volet concerne une seconde approche de criblage in silico des anticorps issus de la sélection in vivo, notamment grâce à l’utilisation de techniques de séquençage haut débit (Pacific Biosciences). Les résultats de cette étude pilote ont permis demettre en exergue plusieurs points : (1) la possibilité d’obtenir des séquences >1000bpcorrespondant à des scFv après analyse par IMGT/HighV-QUEST (database des immunoglobulines internationales) et (2) la possibilité d’identifier des séquences de clones préférentiellement enrichies après une sélection in vivo. En conclusion et perspectives, ces deux méthodes de criblage complémentaires nous donnent accès à de nouvelles voies d’obtention d’anticorps humains pour (1) le couplage à des nanoparticules pour le diagnostic par IRM de la plaque d’athérome ainsi que (2) apporter une thérapie in situ au site inflammatoire. / This thesis is based on the selection of human antibodies and identification of newbiomarkers to develop a diagnosis and a therapy of atherosclerosis. The part one treats, first,the selection of human antibodies in a pathophysiological context in an animal model ofatherosclerosis. To access not only to a large panel of targets but also proteins in their nativeconformation and influenced by their microenvironment, an in vivo selection was performed.In a second time, an innovative high throughput flow cytometry screening was implemented.Contrary to the use of ELISA screening which needs to have an identified target, the flowcytometry doesn’t have this limitation and uses a lower quantity of proteins than ELISAassays. By this screening, two thousand clones were selected. Characterization and specificitytests of these antibodies have yielded to the discovery of galectin 3 has a new biomarker. Thisprotein is implicated in macrophage activation, binding of oxLDL by macrophages to formfoam cells. The second part is about a second screening approach of the antibodies issuingfrom the in vivo selection by using Next Generation Sequencing methods (PacificBiosciences). The results of this primary study allowed for highlighingt two points: (1) thefeasibility to obtain long reads >1000bp identified as scFv after analysis by IMGT/HighVQUEST(international database of immunglobulins) and (2) the feasibility to identify hits ofclones preferentially enriched during the in vivo selection. In conclusion and perspectives,these two complementary methods give the opportunity to obtain human antibodies for (1) thecoupling to nanoparticles for diagnosis by MRI of atheroma plaque and (2) serve as ligandsfor in situ delivery of drugs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017BORD0806 |
| Date | 05 December 2017 |
| Creators | Hemadou, Audrey |
| Contributors | Bordeaux, Jacobin-Valat, Marie-Josée |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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