Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T21:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1
294464.pdf: 1881404 bytes, checksum: 8a3fdfdae373243bd664de40046a7ecb (MD5) / Cedrela fissilis Velloso (Meliaceae) é uma árvore nativa da Floresta Atlântica (Sul do Brasil) de grande interesse econômico devido à sua madeira de qualidade e seu crescimento rápido, ideal para programas de reflorestamento e arborização de espaços urbanos. Assim como as demais espécies da Família Meliaceae, seu metabolismo secundário é caracterizado pela produção de terpenos, que tem despertado grande interesse industrial e medicinal pelas suas atividades inseticida, anti-tumoral, antibiótica, anti-viral, anti-fúngica e anti-malárica. No entanto, as áreas de Floresta Atlântica têm sido suprimidas pela expansão das cidades e da agropecuária no Brasil, colocando em risco toda a biodiversidade deste ecossistema e tornando inviável a exploração sustentável de seus recursos. A cultura vegetal in vitro, através de técnicas de cultura de calos e suspensões celulares, é uma alternativa viável que permite a produção de compostos vegetais de interesse econômico sem que haja a necessidade da exploração dos recursos vegetais in loco, permitindo a conservação das florestas. Assim, este trabalho teve como objetivos estudar o efeito de diferentes condições de cultivo sobre o crescimento, o perfil metabólico e a histologia de calos de C. fissilis. O regulador de crescimento 2,4-D promoveu o crescimento de calos a partir de segmentos nodais cotiledonares e de hipocótilo com uma frequência entre 53,8 # 97,1%, porém demonstrou ser tóxico para segmentos foliares e cotiledonares. Os meios de cultura contendo glucose ou frutose promoveram melhor indução de calos do que os meios de cultura suplementado com sacarose. Calos crescidos na presença de glucose ou frutose formaram maior massa fresca e possuíam elevados teores de água. No entanto, calos crescidos em meio de cultura contendo sacarose formaram maior quantidade de massa seca. Diferentes combinações de BAP e ANA foram testadas e todas apresentaram elevados índices de crescimento de calos na presença de glucose ou frutose no meio de cultura. No meio de cultura contendo sacarose, a calogênese variou entre 48,3 # 86,7%, sendo que a combinação de 5 µM de BAP com 2,5 µM de ANA apresentou a maior taxa de calogênese. Foi observado que a posição do explante interfere na calogênese, e os segmentos nodais cotiledonares inoculados na posição vertical apresentaram maior frequência de calogênese (86,7%) do que os explantes inoculados na posição horizontal (63,3%). Segmentos nodais cotiledonares, segmentos apicais e segmentos de hipocótilo formaram calos em maior frequência e com maior massa fresca e seca. Segmentos de raízes formaram calos com menor massa seca, e segmentos foliares e
cotiledonares formaram elevadas taxas de calos com raízes e com menor massa seca. O cultivo dos calos no escuro aumentou a frequência de calogênese em todos os tipos de explantes, mas provocou uma redução de massa seca. O aumento da concentração de glucose, frutose e sacarose no meio de cultura e do período de cultivo dos calos resultaram em maiores quantidades de massa fresca e seca. A adição de glutamina ao meio de cultura teve efeito inibitório sobre a indução e o crescimento dos calos. Sete formulações salinas de meio de cultura foram testadas, mas apenas no meio de cultura MS foi observava a calogênese. As curvas de dissimilação demonstraram que o crescimento dos calos na presença de frutose ocorre de maneira mais rápida e atinge o estágio estacionário antes dos calos crescidos em meio de cultura contendo glucose ou sacarose, e que a adição de glutamina ao meio de cultura, indiferentemente do açúcar utilizado, aumenta a fase lag e reduz o crescimento dos calos. A análise de varredura em UV-vis apontou a presença de compostos fenólicos, clorofilas e carotenóides nos calos e permitiu comparar a ocorrência destes metabólitos entre diferentes tratamentos. A dosagem de metabólitos secundários demonstrou que os calos crescidos em meio de cultura contendo frutose possuíam o maior teor de clorofila (116 µg/g MF), e que os calos crescidos em meio de cultura contendo sacarose e glutamina possuíam o maior conteúdo de compostos fenólicos totais (17,9 µg/g MS) e de flavonóides (2,89 µg/g). A espectroscopia por FTIR permitiu comparar o perfil metabólico primário e secundário de calos crescidos em diferentes condições de cultivo, evidenciando diferenças quali-quantitativas a nível molecular que podem ajudar a caracterizar os diferentes tratamentos avaliados. Na análise histoquímica de diferentes morfologias de calos foi possível observar que as células possuem grandes vacúolos e que ocorre a formação de arranjos concêntricos de células que caracterizam o início da formação de órgãos. A coloração com PAS reagiu com os carboidratos neutros da parede celular e com os grânulos de amido no citoplasma das células, presentes em grande quantidade nos calos com morfologia nodular. A coloração de AT-O teve apenas uma leve reação metacromática na parede celular das células, indicando pouca ocorrência de açúcares ácidos. A coloração de CBB tingiu de maneira uniforme o citoplasma das células devido à presença de proteínas livres e em organelas e destacou a presença de alguns grânulos protéicos. A calogênese é influenciada pela composição do meio de cultura, condições ambientais de cultivo e por fatores endógenos, como o balanço hormonal de cada tecido e o genótipo da planta doadora dos explantes. As curvas de dissimilação, a análise de metabólitos primários e secundários através de espectroscopia de UV-vis e FTIR e o conhecimento da organização celular através da histoquímica fornecem suporte para a otimização das culturas de calos e para a identificação e seleção de culturas com potencial para a produção de compostos de interesse. / Cedrela fissilis Velloso (Meliaceae) is a fast growing timber tree from Atlantic Forest (South Brazil) which has great economic value due to its high quality wood and its uses in reforestation programs and landscaping of urban areas. As other Meliaceae species, its secondary metabolism is characterized by the production of terpenes of industrial and medicinal interests for its insecticidal, anti-tumor, antibiotic, anti-viral, anti-fungal e anti-malarial activities. However, Atlantic Forest areas have been suppressed by urban and agriculture expansion, which endangers the biodiversity of this ecosystem and make unfeasible the sustainable exploitation of natural resources. In vitro plant tissue cultures, through the use of callus and cell suspension cultures, is a practicable alternative that allows the production of plant compounds of economic interest without the need of plant resources in loco, allowing forests conservation. This work aimed the study the effects of different culture conditions on growth, metabolic profile and histology of C. fissilis callus cultures. The plant growth regulator 2,4-D promoted callus growth from cotyledonary nodal segments and hypocotil segments with a frequency between 53,8 # 97,1%, but showed to be toxic to cotyledon and leaf segments. Culture media containing glucose or fructose promoted higher callus formation than culture medium containing sucrose. Callus growth in the presence of glucose or fructose formed superior fresh weight and had higher water content. In the other hand, callus growth on culture media containing sucrose formed higher dry matter. Different combinations of BAP and ANA were tested and all of them promoted callus growth in culture media containing glucose or fructose. In the presence of sucrose, callus formation ranged between 48,3 # 86,7%, and the combination of BAP 5 ìM with ANA 2,5 ìM induced the best calogenesis frequency. The explant position interfered on callus formation, and the cotyledonary nodal segments inoculated in the vertical position promoted higher callus induction (86,7%) than those inoculated in the horizontal position (63,3%) but no differences on callus growth were observed. Cotyledonary nodal segments, apical segments and hypocotil segments formed callus in a higher frequency and with major fresh and dry matter. Callus from root segments formed less dry matter, and cotyledon and leaf segments formed callus and roots. The increase of sugar concentration in the culture medium and of the culture period promoted the increase in fresh and dry matter. The addition of glutamine to the culture media inhibited callus induction and growth. Seven culture media formulas were tested, but callus formation occurred only in the MS culture medium. Dissimilation curves showed that callus growth is faster in culture medium containing fructose, but cultures reach stationary period earlier. The addition of glutamine to the culture media increased the lag phase and reduced callus growth. The UV-vis screen showed the presence of phenolic compounds, chlorophyll and carotenoids in callus cells and allowed the comparison of these metabolites between calluses from different treatments. The secondary metabolites quantification showed that callus grown in the presence of fructose had the higher chlorophyll content (116 ìg/g FM), whilst callus growth in the presence of sucrose and glutamine had higher phenolic compounds (17,9 ìg/g DM) and flavonoids content (2,89 ìg/g). FTIR spectroscopy allowed the comparison between primary and secondary metabolic profile of calluses grown under different culture conditions and showed qualitative and quantitative differences. The histochemical analysis of different callus morphologies showed cells containing large vacuoles and concentrically cells arrangements that characterizes first stages of organ formation. PAS staining has reacted with neutral carbohydrates of cell walls and starch grains in cells cytoplasm, which were numerous in nodular callus morphology. TB-O staining had a weak metachromatic reaction with cell walls, indicating that acid carbohydrates occurs in low quantity in callus cells. CBB staining reacted with cytoplasm proteins and organelles and with few protein grains. Callus inductions and growth are determined by culture medium composition, environmental conditions and endogenous factors, such as hormonal balance and genotype. Dissimilation curves, primary and secondary metabolites analysis through UV-vis and FTIR spectroscopy, and the study of callus cell organization by histochemistry provided the background for further studies on callus culture optimization and for identification and selection of cultures with potential to produce compounds of economic interest.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/95160 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Pilatti, Fernanda Kokowicz |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Viana, Ana Maria |
| Publisher | Florianópolis, SC |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 116 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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