Lokalisationsmikroskopie ist eine Methodenklasse der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, deren Methoden sich durch stochastische zeitliche Isolation der
Fluoreszenzemission auszeichnen. Das Blinkverhalten von Fluorophoren wird so verändert, dass gleichzeitige Aktivierung von einander nahen Fluorophoren unwahrscheinlich ist. Bekannte okalisationsmikroskopische Methoden umfassen dSTORM, STORM, PALM, FPALM, oder GSDIM.
Lokalisationsmikroskopie ist von hohem biologischem Interesse, weil sie die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops bei minimalem technischem Aufwand um eine Größenordnung verbessert.
Der verbundene Rechenaufwand ist allerdings erheblich, da Millionen von Fluoreszenzemissionen einzeln mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden müssen.
Der Rechen- und Implementationsaufwand dieser Auswertung hat die Verbreitung der superauflösenden Mikroskopie lange verzögert.
Diese Arbeit beschreibt meine algorithmische Grundstruktur für die Auswertung lokalisationsmikroskopischer Daten. Die Echtzeitfähigkeit, d.h. eine Auswertegeschwindigkeit oberhalb der Datenaufnahmegeschwindigkeit an normalen Messaufbauten, meines neuartigen und quelloffenen Programms wird demonstriert.
Die Geschwindigkeit wird auf verbrauchermarktgängigen Prozessoren erreicht und dadurch spezialisierte Rechenzentren oder der Einsatz von Grafikkarten vermieden.
Die Berechnung wird mit dem allgemein anerkannten Gaussschen Punktantwortmodell und einem
Rauschmodell auf Basis der größten Poissonschen Wahrscheinlichkeit durchgeführt.
Die algorithmische Grundstruktur wird erweitert, um robuste und optimale Zweifarbenauswertung zu realisieren
und damit korrelative Mikroskopie zwischen verschiedenen Proteinen und Strukturen zu ermöglichen.
Durch den Einsatz von kubischen Basissplines wird die Auswertung von dreidimensionalen Proben vereinfacht und stabilisiert, um präzisem Abbilden von mikrometerdicken Proben näher zu kommen. Das Grenzverhalten von Lokalisationsalgorithmen bei hohen Emissionsdichten wird untersucht.
Abschließend werden Algorithmen für die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf verbreitete Probleme der Biologie aufgezeigt. Zelluläre Bewegung und Motilität werden anhand der in vitro Bewegung von Myosin-Aktin-Filamenten studiert. Lebendzellbildgebung mit hellen und stabilen organischen Fluorophoren wird mittels SNAP-tag-Fusionsproteinen realisiert. Die Analyse des Aufbaus von Proteinklumpen zeigt, wie Lokalisationsmikroskopie neue quantitative Ansätze jenseits reiner Bildgebung bietet. / Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are
likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost.
However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time.
In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data.
I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them.
I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units.
The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model.
I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples.
I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities.
Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems.
I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging.
Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:10937 |
Date | January 2014 |
Creators | Wolter, Steve |
Source Sets | University of Würzburg |
Language | English |
Detected Language | English |
Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
Format | application/pdf |
Rights | https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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